淀粉是光合作用的终产物之一,也是淀粉贮存库中最主要的贮存物质。植物组织中的淀粉磷酸化酶(α-葡萄糖磷酸化酶)亦称α-1,4-葡萄糖-正磷酸葡萄糖基转移酶,它能在pH7.0-7.5条件下催化淀粉水解为1-磷酸葡萄糖,也能在pH5.1-6.8条件下催化G-1-P合成淀粉,在淀粉代谢中起着重要的作用。

1.原理

    淀粉磷酸化酶能催化葡萄糖-1-磷酸聚合成淀粉,并释放出无机磷,可通过测定释放的无机磷的量来表示酶活性的大小。

淀粉磷酸化酶测定原理

2.试剂

(1).100 mmol·L-1 Tris-MES(pH7.2)缓冲液,内含1%PVP(质量浓度)为酶的提取介质。
(2).100 mmol·L-1 Tris-MES(pH6.0)缓冲液,内含1 mmol·L-1 NaF,0.5%可溶性淀粉(质量浓度),即酶的反应介质。
(3).10 mmol·L 1-磷酸葡萄糖(G-1-P)。
(4).5%三氯乙酸(TCA)
(5).定磷试剂
(6).无机磷贮备液

3.方法步骤

3.1.制作标准曲线

3.2.样品测定

(1)酶液提取:剥取小麦籽粒10-30粒。称重放入预冷的研钵中,按W:V=1:5加入酶提取介质,快速冰浴中研磨成匀浆。研磨液经4层纱布过滤后,在4℃12000g离心10min倒出上清液即为粗酶液。
(2)酶活性反应:取试管3支,加入0.2mL反应介质,0.65mL蒸馏水,0.05mL酶液,最后加入0.1mL G-1-P起始反应,在30℃水浴中保温10min。加入0.5mL 5%TCA终止反应。对照先加入TCA再加酶液,其他操作步骤同上。将反应后的溶液在4000g离心10min弃去沉淀。取上清液作无机磷测定。
(3)无机磷的测定:吸取上清液0.3mL加入试管,加蒸馏水2.7mL,再加3mL定磷试剂后摇匀,在45℃水浴中保温25min,取出冷却至室温,于660nm波长下测定吸光度,从标准曲线查得Pi含量。

4.结果计算

将测定的样品液的吸光度代入到标准曲线方程式中,计算出相应的硝态氮含量,然后按下式计算植物组织硝态氮含量:

淀粉磷酸化酶活性计算

式中,C:从标准曲线查得的无机磷量(μg);FW:样品鲜重(g);t:反应时间(min);Vt:提取酶液总体积(mL);Vs:测定时取用酶液体积(mL);n:提取液测定中的稀释倍数(×5)。

5.注意事项

G-1-P易分解,应现配现用。

400-066-8286