蔗糖是重要的光合产物,是植物体内运输的主要物质,又是碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。对这两种酶活性的测定,可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。本文将会介绍蔗糖合成酶(SS)与蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性测定的原理、实验方法以及注意事项。

蔗糖合成酶

原理:

      蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖供体UDPG反应生成蔗糖。

蔗糖合成酶活性测定原理

      这是一个可逆反应,平衡常数为1.3-2.0。该酶在分解方向的Km值相对较高(30-150 mmol·L-1-1),细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定(外加底物UDPG和果糖,测产物蔗糖的量表示酶活性),也可以在分解方向进行测定(外加蔗糖和UDP,测定果糖含量表示酶活性)。

      蔗糖磷酸合成酶(SPS)催化UDPG与果糖-6-磷酸(F6P)结合形成磷酸蔗糖:

蔗糖磷酸合成酶活性测定原理

      6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶(SPP)水解后形成蔗糖。实际上最近有证据表明SPS和SPP可以在体内形成一复合体,因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。酶活性测定是外加UDPG和F6P,测定产物蔗糖的量表示酶活性。

      一般把SPS-SPP系统看做是蔗糖合成的主要途径,而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。

      果糖是酮糖,可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物,在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖,也能生成红色产物,在480nm处可比色测定。

试剂

(1).提取缓冲液:100 mmol·L-1 Tris-HCl(pH7.0)缓冲液,内含5 mmol·L-1 MgCl2,2 mmol·L-1 EDTA-Na2,2%乙二醇,0.2%牛血清清蛋白(BSA),2% PVP,5 mmol·L-1 DTT。
(2).透析缓冲液:25 mmol·L-1 Tris-HCl(pH7.0)缓冲液,内含2.5 mmol·L-1 MgCl2,1 mmol·L-1 EDTA-Na2,1%乙二醇,1 mmol·L-1 DTT。
(3).酶反应液:100 mmol·L-1 Tris-MES(pH7.0)缓冲液,内含10 mmol·L-1果糖(F6P)5 mmol·L-1 醋酸镁,5 mmol·L-1 DTT。
(4).10 mmol·L-1 UDPG:称取0.012206g UDPG,配成2 mL,浓度即为10 mol·L-1 UDPG,随配随用。
(5).2mol·L-1 NaOH。
(6).30%HCl。
(7).0.1%间苯二酚:0.1g间苯二酚溶于100mL 95%乙醇中,棕色瓶保存。
(8).1 mg·mL-1蔗糖标准液。

方法步骤:

(1).酶液制备:称取1g预先剥粒备用额小麦籽粒,置于预冷的研钵中,分批加入5mL提取缓冲液,冰浴研磨提取,2℃下10000g离心20 min,上清液3 mL装入透析袋中,透析袋置于透析缓冲液中4℃透析过夜,其间更换透析液3次,透析后酶液定容5mL备用。
(2).蔗糖合成酶活性测定:取3支10mL具塞试管,加入0.4mL酶反应液,0.1mL UDPG和0.05mL透析后的酶液,补水至1mL,于30℃水浴中反应10min后,沸水浴3min中止反应。对照用蒸馏水代替UDPG。
(3).蔗糖含量测定:往各反应试管中加入2 mol·L-1 NaOH 0.1mL,沸水浴10min后,冷却至室温。加30%HCl 3.5mL,0.1%间苯二酚1mL,摇匀后于80℃保温10min,冷却后480nm处比色,测定蔗糖生成的量。
(4).蔗糖磷酸合成酶反应:在酶反应液中用10mol·L-1果糖-6-磷酸代替果糖,其余均按蔗糖合成酶的方法测定。
(5).标准曲线制作:取7支10mL具塞试管,并按下表加入各种试剂,按上述步骤3反应并测定其吸光度。以吸光度值为纵坐标,蔗糖含量为横坐标,绘制标准曲线,以计算反应中蔗糖形成的数量。

试剂 试管号
1 2 3 4 5 6 7
1 mg·mL-1蔗糖标准液/mL 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水/mL 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0
蔗糖含量/mg 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
A480

(6).结果计算:蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活力单位均为mg蔗糖·g-1FW·h-1

蔗糖合成酶活性测定计算公式

式中,C:从标准曲线查得的蔗糖量(mg);FW:样品鲜重(g);t:反应时间(h):Vt:提取酶液总体积(mL);Vs:测定时取用酶液体积(mL);n:提取液测定中的稀释倍数。

注意事项:

透析袋不可装满,以防止吸水胀破。

400-066-8286