方法原理
该方法是基于以下5个假设:
①被杀死的微生物生物量中的碳较活体中的碳能更快地被分解;
②熏蒸灭菌处理很完全;
③没有熏蒸灭菌的土壤，在培养期间微生物死亡极少，可以忽略不计;
④被熏蒸杀死的微生物，在培养期间被分解的比例，所有土壤都一样，即所有的土壤可以用一个共同的转换系数Kc值;
⑤熏蒸灭菌处理对士壤物理和化学性质没有任何影响。
实际上，完全符合这5个假设是不可能的。目前所用的方法是基于土壤经氯仿薰蒸处理后，再进行培养时，有大量的CO2释放出来。所释放CO2是来源于被氯仿薰蒸杀死的微生物。以不薰蒸土壤在培养期间所释放的CO2量做为空白,根据二者之间的差值来计算土壤微生物生物量碳。该方法最大的困难是空白的选择，目前还没有统一的看法。该方法不适用于pH＜4.5的酸性土壤,也不能用于含有大量易分解有机物的土壤，用于渍水土壤和石灰性土壤时也要慎重。
仪器及设备
培养箱;真空干燥器;真空泵;往复式振荡机(速率200次每min);1L广口玻璃瓶。
试剂
| 1.氢氧化钠溶液[c(NaOH)= 1 mol • LL-1]:称取40. 0g氢氧化钠(NaOH,分析纯)浴于去离子水中稀释至1 L; |
| 2.盐酸标准溶液[c(HCl)= 0.05 mol • LL-1 ]:量取约4.2 mL的盐酸(HCl,ρ=1.19g • mLL-1，分析纯)，放入1000 mL容量瓶中,用去离子水定容。用Na2CO3标定其准确浓度; |
| 3.氯化钡溶液[c(BaCl2)=1 mol • L-1]:称取244 28 g氧化钡(BaCl2 • 2H20,分析纯)溶于去离子水中，稀释至1 L; |
| 4.酚酞指示剂:0.5g酚酞溶于50 mL 95%乙醇中，再加50 mL去离子水，滴加氢氧化钠溶液[c(NaoH)=0.0l mol • L-1]至指示剂呈极淡的红色; |
| 5.氯化钾溶液[c(KCl)=2 mol • L-1]:称取149. 0g氯化钾(KCI,分析纯)溶于去离子水中稀释至1 L; |
| 6.无乙醇氯仿(CHCl3):市售的氯仿都含有乙醇(作为稳定剂),使用前必须除去乙醇。方法为:量取500 mI氯仿于1000 mL分液漏斗中，加人50 mL硫酸溶液[φ(H2SO4)=5%],充分摇匀,弃除下层硫酸溶液，如此进行3次。再加人50 mL去离子水，同上摇匀,弃去上部的水分，如此进行5次。将下层的氯仿转移到蒸溜瓶中,在62℃的水浴中蒸馏,馏出液存放在棕色瓶中,并加人约20 g无水K2CO3,在冰箱的冷藏室中保存备用。 |
操作步骤
1.薰蒸 称取相当于 25.0g烘干土重的湿润土壤3份分别放在约100 mL的玻璃瓶中，起放人同一干燥器中,干燥器底部放置几张用水湿润的滤纸，同时分别放人一个装有50mLNaOH溶液和一个装有约50mL无乙醇氯仿的小烧杯(同时加入少量抗暴沸的物质),用少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽气至氯仿沸腾并保持至少2 min.关闭干燥器的阀门,在25℃的黑暗条件下放置24 h。打开阀门，如果没有空气流动的声音,表示干燥器漏气，应重新称样进行薰蒸处理。当干燥器不漏气时，取出装有水和氯仿的玻璃瓶,氯仿倒回瓶中可重复使用。擦尽干燥器底部，用真空泵反复抽气,直到土壤闻不到氯仿气味为止。同时称同样量的土壤3份，不进行薰蒸处理，放人另一个真空干燥器中，作为对照。
2.培养 向每份薰蒸处理的土壤加人10 mg未薰蒸的新鲜土壤，混合均匀。调节土壤含水量到田间持水量的55%左右，放人约1 L的广口瓶中(每瓶放入一个土样)，同时放人一个装有5 mL NaOH溶液和一个盛有20 mL去离子水的玻璃瓶，密封广口瓶。在25℃的黑暗条件下培养10d。不加新鲜土壤，将对照土壤作同上处理,再做3个不加任何土壤的空白对照。
3.测定CO2 培养结束后,取出装有NaOH溶液的玻璃瓶，立即全部转移到100mL的容量瓶，定容。准确吸取10mL于150 mL三角瓶中，加入10mL去离子水和1 mL BaCl2溶液,再加人2滴酚酞指示剂，用盐酸标准溶液(试剂2)滴定至终点。
4.微生物量氮的浸提与测定培养结束后,将薰蒸和未薰 蒸的土样分别全部转移到250 mL三角瓶中，立即加人100 mL KCl溶液(试剂5),在往复式振荡机上浸提30 min(液土比为4:1),滤液立即测定或放在低温下存放。滤液中的NH4+和NO3分别用靛酚兰比色法和代氏合金还原蒸馏法测定。
结果计算
1. CO2-C的释放量(Fc)
ω(C)=(V1-V2)×c×M×1000×ts/m
式中:ω(C)——CO2-C 的释放量(Fc)质量分数mg • kg-1;
V1——土样处理滴定时所消耗的盐酸体积,mL;
V2——无土空白对照滴定时所消耗的盐酸体积,mL;
c——盐酸标准溶液 的浓度,mol • L-1;
M——碳的毫摩尔质量 M(C)= 12 mg/mmol;
1000一转换为 kg的系数;
ts——分取倍数;
m——土壤样品的烘干质量,g。
2.微生物生物量碳(Bc)的计算:
ω(C)=Fc/Kc
式中:ω(C)——微生物生物量碳(Bc)的质量分数,mg • kg-1;
Fc——0天~10天培养期间薰蒸土壤释放的CO2-C量与未薰蒸土样培养期间释放的CO2-C量的差值,mg • kg-1;
Kc——培养期间被杀死的微生物矿化成CO2-C的比例，常取0.45。
3.微生物生物量氮(BN)的计算:
ω(N)=FN/KN
式中:ω(N)——微生物量氮(BN)质量分数,mg • kg-1;
FN=[(薰蒸土样中NO3--N + NH+-N)-(未薰蒸土样中NO3--N+ NH4+-N)],mg • kg-1;
KN为培养期间被杀死的微生物量中的氮转化为NH4+-N和NO3--N的比例，一般为0.57。
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