由于土壤酶主要是以被吸附的状态累积在土壤颗粒的表面，所以在绝大多数情况下，土壤酶的活性是在土壤称量（酶的数量)、底物浓度、培养温度及反应混合物的pH值均处于最适时，根据一定时间间隔内酶催化反应过程中生成的产物量或剩余的底物量间接测得的.

    土壤酶活性的测定，首先要求将微生物的活性与土壤酶的活性区别开来.也就是说，要求有效地抑制土壤样本中微生物的增殖，并在不破坏土壤理化性质的情況下使土壤酶量保持不变.对抑制剂的基本要求是；它们能有效地抑制微生物的生命活动而不破坏微生物细胞（不引起质壁分离及胞溶）和改变细胞壁的透性，这样，便能防止微生物对于底物和反应产物的利用及附加数量的酶进入土壤.

    实际上，能完全抑制所有微生物的活性而不影响脱离活体的土壤胞外酶的抑制剂是很难找到的.在土壤酶学研究中，最广泛釆用的抑制剂是甲苯.据认为，它能阻止酶的合成、微生物的增殖及其对底物或反应产物的利用。在酶活性测定中，它的使用量通常为反应混合物的容积的10-25%. 一般地说，甲苯确能抑制微生物的增殖，并仅导致极少量的微生物细胞的胞溶.但是，它并不能完全使土壤灭菌.存活的微生物仍能合成新的酶和利用底物或反应产物.在个别情况下，甲苯甚至能刺激微生物的生长.对于土壤酶本身（特别是对氧化还原酶类），甲苯有时也有抑制作用.因此，有必要进行预备试验，以确定甲苯的抑制效果.

    高能电离辐射是土壤酶学研究中最接近理想的土壤灭菌剂.几乎能使土壤完全灭菌而保持土壤酶活性.一般地说，多细胞生物比单细胞生物、微生物细胞比土壤胞外酶对电离辐射更为敏感.不过，经辐射灭菌后，土壤微生物仍可能保持几天的生物化学活性，因为辐射虽能影响微生物的发育，但不一定影响它们的酶活性，甚至反而会增强死细胞膜的透性. 辐射还会引起土壤理化性质的某些改变，例如土壤团聚体的稳定性减小和无机营养物质的更多释出，不同种类的土壤微生物均有其一定的钝化界数.要测知其辐射后的存活率是比较困难的.为此，在确定辐射剂量和时间时，同样要进行预备试验.

    许多因素会影响酶催化反应的速率，从而影响土壤酶活性的测定.其中最主要的有：土壤称量(酶的数量）、底物浓度、温度、pH、缓冲液的组分和培养时间.因此，土壤酶活性测定的笫二个要求是:应确定这些参数的最适值，以获得相对满意的结果.

    土壤称量应以其吸附的酶分子完全被底物饱和为依据 (在未被饱和时，酶催化反应的速率与底物浓度成正比），底物浓度的选择，应考虑到使反应速率在整个反应期间保持恒定.为此，要求底物有些过量.但是，底物的大量过剩也会降低反应的速率.对底物的基本要求是它有很好的溶解性.不溶性或溶解性较差的底物是很难与酶作用的.一定土壤称量的最适底物浓度，需通过实验得到。

    测定土壤酶活性的最适温度，并不一定是供试酶类的最适温度.根据国际酶学委员会的建议，测定湿度应在30℃左右.

    选用缓冲液是为了使反应浞合物的pH值在反应过程中保持恒定.它有几个标准：
(1)缓冲液的组分不致影响供试酶类的活性及土壤性质；
(2)缓冲液的pH值应等于或接近于供试酶类的最适pH值；
(3)缓冲液应能将反应混合物的pH值调节至最大酶活性时的pH值，并使其在整个反应过程中保持一定.

    酶催化反应的持续时间（培养时间）的选定，以反应速率保持恒定为基准.由于土壤酶的活性相对较低，所以培养时间应比较长——从几小时到几昼夜.尽管如此，仍应尽可能地缩短培养时间.这是因为，主要由于下述原因，较长时间后的酶反应速率可能会发生变化：
(1)酶本身的部分被破坏
(2)生成的反应产物对酶活性产生了专性抑制
(3)暂受抑制的微生物重新得到了增殖.

    土壤酶活性测定的另一个要求，是要设置几种对照，以校正测定结果：

（1）无酶对照这对测定氧化还原酶类的活性是绝对必要的，因为在土壤中经常存在着能转移电子的变价阳离子 (Cu、Mn、Fe、Mo等），它们能进行非酶催化反应.为了将后者与酶催化反应区别开来，有必要完全排除酶的作用. 对此，一般是将土壤在180℃时干热灭菌2-3小时或在2个大气压下多次热压处理1小时.由于这种处理能使土壤有机质溶解和使滤液着色，所以在用比色法和滴定法测定酶活性时不宜采用，而需代之以专性的化学抑制剂-重金属的盐、氰化物等.

（2）无底物对照土壤中常含有与底物的催化分解产物类似或相同的物质（如葡萄糖、氨基酸、磷、铵等）.为此，需用一定体积的水代替底物，以真正获悉酶催化反应中生成的产物量

（3）无土对照这是为了检验酶活性测定中所用试剂和底物的纯度以及底物的自身分解情况.
在测定水解酶类的活性时，若已确证供试土壤中不会产生底物的非酶催化水解，可仅设置无底物对照和无土对照. 在测定氧化还原酶类的活性时，则还需设置无酶对照。