超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)是生物体内普遍存在的参与氧代谢的一种含金属酶(有Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种类型)。该酶与植物的衰老及抗逆性密切相关,是植物体内重要的保护酶之一,因此SOD活性的测定在研究植物衰老及抗逆机制中有着重要意义。本文将会介绍超氧化物岐化酶活性测定的原理、方法实验步骤以及实验注意事项。

超氧化物岐化酶

原理

SOD可催化超氧物阴离子自由基(O2-)发生歧化反应,生成O2和H2O2,生成的2可被过氧化氢酶分解为O2和H2O

测定原理公式

    测定SOD活性的方法较多,我们使用的是NBT(氮蓝四唑)光还原法。该方法的原理是:当反应体系中有可被氧化的物质(如甲硫氨酸)时,核黄素可被光还原,还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化,使02被单电子还原产生O2-,O2-则可将NBT还原成蓝色的甲䐶,后者在560nm处有最大吸收值。SOD能够清除O2- ,当反应体系中有SOD存在时可抑制NBT的还原,酶活性越髙,抑制作用越强,反应液的蓝色越浅。因此可通过测定A560。来计算SOD活性,以抑制NBT光还原反应50%所需的酶最为一个酶活性单位。

试剂

(1)50 mmol·L-1 磷酸缓冲液(pH 7.8)。
(2)130 mmol·L-1甲硫氨酸(Met)溶液:称取1.9389 g Met用磷酸缓冲液溶解定容至 100 mL.
(3)750 μmol·L-1 NBT溶液:称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液溶解定容至100 mL,避光保存。
(4)20 μmol·L-1 核黄素溶液:称取0.0075g核黄素用磷酸缓冲液溶解定容至1000 mL,随用随配,避光保存。
(5)100 μmol·L-1 EDTA-Na2溶液:称取0.0372 g EDTA-Na2•2H2O,蒸馏水溶解定容至 1000 mL.
(6)SOD提取介质:50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH7.8)内含1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

方法步骤

(1)SOD的提取:称取植物材料0.5g于预冷的研钵中,加2mL预冷的提取介质在冰浴中研磨匀浆,转移至10mL量瓶中,用提取介质冲洗研钵2-3次(每次1-2mL),合并冲洗液于量瓶中,定容至10mL。取5mL提取液与4℃下10000r/min离心15min,上清液即为SOD粗体液。

(2)SOD活性测定:取透明度好、质底相同的15mm×150mm试管7支,测定管3支、光下对照各三支,暗中对照(调零)1支,按下表加入反应显色试剂。

反应试剂/mL 测定管 光下对照 暗中对照
1 2 3 4 5 6 7
50 mmol·L-1 磷酸缓冲液 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
130 mmol·L-1Met溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
750 μmol·L-1 NBT溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
100 μmol·L-1EDTA-Na2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
20 μmol·L-1核黄素溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
粗酶液 0.1 0.1 0.1 0 0 0 0
蒸馏水 0.5 0.5 0.5 0.6 0.6 0.6 0.6

    7号试管加入核黄素后立即用双层黑色硬纸套遮光,全部试剂加完后摇匀,将试管置于4000 1×荧光灯下显色反应15-20min(要求各管照光要一致,反应温度控制在25-35℃之间,视光下对照管的反应颜色和酶活性的高低适当调整反应时间)。反应结束后黑布罩遮盖试管终止反应。以暗中对照作空白(凋零),在560nm下测定1-6号试管反应液的吸光度,记录测定数据。

(3)结果计算:

计算公式

    式中,A0:光下对照管吸光度;As:样品测定管吸光度;Vt:样品提取液总体积(mL);Vs:测定时取粗酶液量(mL);t:显色反应光照时间(min);FW:样品鲜重(g)

注意事项

(1)显色反应过程中要随时观察光下对照管的颜色变化,当A0达到0.6-0.8时终止反应。
(2)当光下对管反应颜色达到要求的程度时,测定管(加酶液)未显色过颜色过淡,说明酶对NBT的光还原抑制作用过强,应对酶液进行适当稀释后再显色,以能抑制显色反应的50%为最佳。
(3)植物组织中的酚类物质对测定有干扰,对酚类含量高的材料提取酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

400-066-8286