超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物体内普遍存在的参与氧代谢的一种含金属酶（有Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种类型）。该酶与植物的衰老及抗逆性密切相关，是植物体内重要的保护酶之一，因此SOD活性的测定在研究植物衰老及抗逆机制中有着重要意义。本文将会介绍超氧化物岐化酶活性测定的原理、方法实验步骤以及实验注意事项。

原理

SOD可催化超氧物阴离子自由基（O₂^-）发生歧化反应，生成O₂和H₂O₂,生成的₂可被过氧化氢酶分解为O₂和H₂O

    测定SOD活性的方法较多，我们使用的是NBT(氮蓝四唑）光还原法。该方法的原理是：当反应体系中有可被氧化的物质（如甲硫氨酸）时，核黄素可被光还原，还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化，使02被单电子还原产生O₂^-，O₂^-则可将NBT还原成蓝色的甲䐶，后者在560nm处有最大吸收值。SOD能够清除O₂^- ,当反应体系中有SOD存在时可抑制NBT的还原，酶活性越髙，抑制作用越强，反应液的蓝色越浅。因此可通过测定A₅₆₀。来计算SOD活性，以抑制NBT光还原反应50%所需的酶最为一个酶活性单位。

试剂

(1)50 mmol·L^-1 磷酸缓冲液（pH 7.8)。
(2)130 mmol·L^-1甲硫氨酸（Met)溶液：称取1.9389 g Met用磷酸缓冲液溶解定容至 100 mL.
(3)750 μmol·L^-1 NBT溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液溶解定容至100 mL,避光保存。
(4)20 μmol·L^-1 核黄素溶液:称取0.0075g核黄素用磷酸缓冲液溶解定容至1000 mL,随用随配，避光保存。
(5)100 μmol·L^-1 EDTA-Na₂溶液：称取0.0372 g EDTA-Na₂•2H₂O，蒸馏水溶解定容至 1000 mL.
(6)SOD提取介质：50 mmol·L^-1磷酸缓冲液（pH7.8)内含1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。

方法步骤

（1）SOD的提取：称取植物材料0.5g于预冷的研钵中，加2mL预冷的提取介质在冰浴中研磨匀浆，转移至10mL量瓶中，用提取介质冲洗研钵2-3次（每次1-2mL），合并冲洗液于量瓶中，定容至10mL。取5mL提取液与4℃下10000r/min离心15min，上清液即为SOD粗体液。

（2）SOD活性测定：取透明度好、质底相同的15mm×150mm试管7支，测定管3支、光下对照各三支，暗中对照（调零）1支，按下表加入反应显色试剂。

反应试剂/mL	测定管			光下对照			暗中对照
	1	2	3	4	5	6	7
50 mmol·L-1 磷酸缓冲液	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
130 mmol·L-1Met溶液	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
750 μmol·L-1 NBT溶液	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
100 μmol·L-1EDTA-Na2	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
20 μmol·L-1核黄素溶液	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
粗酶液	0.1	0.1	0.1	0	0	0	0
蒸馏水	0.5	0.5	0.5	0.6	0.6	0.6	0.6

    7号试管加入核黄素后立即用双层黑色硬纸套遮光，全部试剂加完后摇匀，将试管置于4000 1×荧光灯下显色反应15-20min（要求各管照光要一致，反应温度控制在25-35℃之间，视光下对照管的反应颜色和酶活性的高低适当调整反应时间）。反应结束后黑布罩遮盖试管终止反应。以暗中对照作空白（凋零），在560nm下测定1-6号试管反应液的吸光度，记录测定数据。

（3）结果计算：

    式中，A₀:光下对照管吸光度；A_s：样品测定管吸光度；V_t：样品提取液总体积（mL）；V_s：测定时取粗酶液量（mL）；t：显色反应光照时间（min）；FW：样品鲜重(g)

注意事项

（1）显色反应过程中要随时观察光下对照管的颜色变化，当A₀达到0.6-0.8时终止反应。
（2）当光下对管反应颜色达到要求的程度时，测定管（加酶液）未显色过颜色过淡，说明酶对NBT的光还原抑制作用过强，应对酶液进行适当稀释后再显色，以能抑制显色反应的50%为最佳。
（3）植物组织中的酚类物质对测定有干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。