核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶( ribulose - 1,5 - bisphosphate carboxylase,RuBPCase)是光合作用碳代谢中的重要的调节酶,是植物中最丰富的蛋白质,主要存在于叶绿体的可溶部分,总量约占叶绿体可溶蛋白50%-60%。本实验分别用分光光度法和同位素法测定酶的羧化能力。

1.原理

    在RuBPCase的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)与1分子的CO2结合,产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA),PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用,产生甘油醛-3-磷酸,并使还原型辅酶I(NADH)氧化,反应如下:

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性测定

这里1分子CO2被固定,就有2分子还原型辅酶I被氧化。因此,由辅酶I氧化的量就可计算RuBPCase的活性,由340nm吸光度的变化可计算还原型辅酶I氯化的量。

为了使NADH的氧化与CO2的固定同步,从而需要加人磷酸肌酸(Cr~P)和磷酸肌酸激酶的ATP再生系统。

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性测定

2.材料及仪器

(一)材料

    菠菜叶片、小麦及水稻叶片。

(二)仪器设备

    紫外分光光度计,冷冻离心机,匀浆器,移液管,秒表。

(三)试剂

    (1) 5 mmol/L NADH。

    (2) 25 mmol/L RuBP。

    (3) 0.2 mol/L NaHCO3。

    (4) RuBPCase 提取介质: 40 mmol/L(pH 7.6)Tris - HCl缓冲溶液,内含10 mmol/L MgCl2、0.25 mmol/L EDTA、5 mmol/L 谷胱甘肽。

    (5)反应介质:100mmol/LTria-HCl缓冲液,内含12mmol/LMgCl2和0.4 mmol/L EDTA•Na2pH 7.8。

    (6)160u/ml.磷酸肌酸激酶溶液。

    (7)160u/mL甘油醛-了-磷酸脱氢酶溶液。

    (8) 50 mmol/L ATP。

    (9)50mmol/L磷酸肌酸。

    (10)160u/mL磷酸甘油酸激酶溶液。

    (11)菠菜的RuBPCase提取液。

3.实验步骤

1.酶粗提液的制备

    取新鲜菠菜叶片10g,洗净擦干,放勾浆器中,加人10 mL预冷的提取介质,高速匀浆30s,停30s,交昝进行3次;勾浆经4层纱布过滤,滤液于20 000x g4℃下离心15min,弃沉淀;上清液即酶粗提液,置0C保存备用。

2.RuBPCase活力测定

表1 各溶剂含量及配制
试剂 加入量/mL 试剂 加入量/mL
5mmol/L NADH 0.2 160u/mL磷酸肌酸激酶 0.1
50mmol/L ATP 160u/mL    
酶提取液 0.1 160u/mL磷酸甘油酸激酶 0.1
50mmol/L Cr~P 0.2 160u/mL磷酸甘油醛脱氢酶 0.1
0.2mol/L NaHCO3 0.2 蒸馏水 0.3
反应介质 1.4    

    将配制好的反应体系摇匀,倒人比色杯内,以蒸馏水为空白,在紫外分光光度计上340nm处反应体系的吸光度作为零点值。将0.1mL,RuBP加于比色杯内,并马上计时,每隔30s测一次吸光度,共测3min。以零点到第一分钟内吸光度下降的绝对值计算酶活力。

    由于酶提取液中可能存在PGA,会使酶活力测定产生误差,因此除上述测定外,还需做一个不加RuBP的对照。对照的反应体系与上.述酶反应体系完全相同,不同之处只是把酶提取液放在最后加,加后马,上测定此反应体系在340 nm处的吸光度,并记录前一分钟内吸光度的变化量,计算酶活力时应减去这一变化量。

4.计算结果

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性测定计算公式

    式中:△A为反应最初Imin内340nm处吸光度变化的绝对值(减去对照液最初1min的变化量);N为稀释倍数;6.22为每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数;2表示每固定1 mol CO2有2 mol NADH被氧化;△t为测定时间1 min;d为比色光程,cm。

 

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