RuBP羧化酶是一种双功能酶,既可催化RuBP的羧化反应,又可催化加氧反应,故其全名为RuBP羧化酶/加氧酶(RuBP carboxylase/oxygenase,简称Rubisco)。Rubisco普遍存在于自养生物中,在C3植物中含量极为丰富,占叶可溶性蛋白质的50%以上,是自然界最丰富的的一种蛋白质。在叶绿体间质中浓度可达300mg/mL.同时Rubisco也是高等植物中有机氮的重要贮藏形式。本文介绍了同位素法测定RuBP羧化酶活性的实验流程。

RuBP羧化酶

1.原理

    在一定的反应体系中,Rubisco催化RuBP与Na214CO3发生羧化反应,生成酸稳定的三碳化合物(1-14C)-3-PGA,因此可用液体闪烁计数器测定产物中14C的强度来计算酶的活力。

2.试剂

(1).50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液1,pH8.2
(2).10 mmol·L-1 RuBP,pH6.5
(3).10 mmol·L-1 NaH14CO3(0.2 μCi·μmol-1
(4).20 mmol·L-1 MgCl2
(5).20 mmol·L-1 DTT。
(6).闪烁液:由0.8g 2-苯基-5-(4-二苯基)1,3,4-噁唑、0.5g 4-双-2-(5-苯基噁唑基)苯、500mL TrtonX-100和1000mL 甲苯组成。
(7).Rubisco 粗酶液提取介质:40 mmol·L-1(pH7.6)Tris-HCl缓冲液,内含10 mmol·L-1 MgCl2、0.25 mmol·L-1 EDTA和5.0 mmol·L-1谷胱甘肽
(8).2 mol·L-1 HCl

3.方法步骤

(1).粗酶提液的制备:取新鲜菠菜叶10g,洗净擦干,在匀桨器中加入10mL预冷的提取介质,高速匀浆30s,停30s,再匀浆30s,反复3次,匀浆经4层纱布过滤,滤液于4℃下20000g离心15min,弃沉淀;上清液即粗酶提取液。置0℃保存备用。
(2).Rubisco羧化活性测定:按下表配制酶反应体系。

试剂名称 加入体积/μL
50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液 pH8.2 20
10 mmol·L-1 NaH14 CO3(0.2μCi/μmol) 10
10 mmol·L-1 MgCl2 40
20 mmol·L-1 DTT 20
粗酶提取液 10

    将反应体系配好后摇匀,在30℃下预热10min,使酶活化,再加入10μL 10mmol·L-1 RuBP为反应开始。反应5min后,加入200μL 2 mol·L-1 HCl终止反应。将反应后的反应液在闪烁管中于90℃下干燥以除去未固定的CO2,然后向管中加入0.1mL蒸馏水,使之溶解,再加入5mL闪烁液,用液体闪烁计数器测定脉冲数,计算酶活力。

(3).结果计算

CO2的固定量由含14C的酸稳定化合物中的比放射性(mil)计算,每小时内,每克鲜重植物的酶活力单位如下。

RuBP羧化酶活性计算

式中,cpm:每分钟脉冲数;3.997:每1μCi14C相当于3.997 CO2μmol数;60:1h=60min;V:提取液总体积;0.7:液体闪烁仪测定14C时的效率;FW:样品鲜重(g);2.22×106:每分钟内1 μCi14C的蜕变数;5:反应时间(min);0.01:反应体系中所用的酶液体积(mL)。

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