原理:

      聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体进行电泳的方法。核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)分子在一定pH值的缓冲液中带有电荷,将其放人电场中,则可向与其所带电荷电性相反的电极移动。聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应,核酸分子大小、形状不同,故在电场作用下,核酸分子在聚丙烯酰胺凝胶中泳动速度不同,依此可达到分离纯化的自的。本文详细介绍了RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳,包括聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理,实验所需试剂,实验步骤。

材料、仪器设备及试剂

(一)材料

      RNA样品液。

(二)仪器设备

      电泳仪,玻璃管,试管架,穿刺针头,注射器。

(三)试剂

      (1) 20%的单体母液:取重结晶的丙烯酰胺19.0g及甲叉双丙烯酰胺1.0g,蒸馏水溶解,稀释至100mL。

      (2) Tris-硼酸一EDTA(TBE)缓冲液:称Tris 108.8 g,硼酸55.0g, EDTA -Na29.3g蒸馏水溶解,稀释至1000mL,pH为8.3。用于电极缓冲液时再稀释10倍。

      (3) β一DMAPN(二甲基氨基丙腈)。

      (4) 1.6%过硫酸铵溶液:称取0.16 g过硫酸铵溶于10 ml.水中。

      (5) 20%蔗糖-0.2%溴酚蓝溶液:取蔗糖20g,溴酚蓝0.2 g溶子100 mL水中。

      (6) 0.2%甲烯蓝染液:取0.2 g甲烯蓝溶于100 mL pH4.7的0.4 mol/L HAc缓冲液中,过滤后使用。

      (7) 6%HAc液:取HAc 60 mL加水至1 000 mL。

RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验步骤:

(一)制胶

      (1)取玻管(8 cmx0.5 cm)2支,下端用胶布封闭管口,垂直立在试管架上。

      (2)取单体母液3 mL、缓冲液1.5 mL、β- DMAPN0.06 mL、水10 mL混匀,再加过硫酸铵0.94mL,混匀后立郎分装于各管至刻度处,沿玻管加几滴水封面,静置待凝固。

(二)加样

      (1)取少量RNA样品液和RNA标准液分别如人等体积的20%蔗糖和0.2%溴酚蓝待用。

      (2)剥去凝胶管下端胶布,倒出凝胶表面水,用电泳缓冲液洗涤凝胶表面三次,凝胶管内加满缓冲液,插人电泳槽中,上下槽加足电泳缓冲液,每支凝胶管加rna样品10~ 20 μL(含RNA 50~ 100 μg)。

(三)电泳

      接通电泳仪电源,上槽接负极,下槽接正极。开始时电流应小一些,以每支凝胶1~2mA为宜。待样品进人凝胶后增加至每支凝胶3mA,调至所需电流并保持。待溴酚蓝迁移至距凝胶管下端2cm处关闭电源停止电泳,取出凝胶管。

(四)染色及观察

      (1)用5mL注射器吸满蒸馏水,安上穿刺针头,针尖紧贴玻管壁,边旋边向凝胶管侧壁注入水剥离凝胶。

      (2)将凝胶放入染色液中染色1 h,再用6% HAc脱色,更换数次脱色液,直到背景清晰,一般需脱色24h。

      (3)将凝胶泡在6%HAc中,取出后在紫外灯下观察,比较不同样品的电泳区带。

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