本文介绍了斐林试剂比色法测定还原糖的测定方法，包括还原糖测定的原理，实验所需试剂，实验步骤以及实验注意事项。

原理：

      植物组织中的可溶性糖可分为还原糖(主要是葡萄糖和果糖)和非还原糖(主要是蔗糖)两类。还原糖具有醛基和酮基.在碱性溶液中煮沸.能把斐林试剂中的Cu²⁺还原成Cu⁺,使蓝色的斐林试剂脱色,脱色的程度与溶液中含糖量成正比，在590nm波长下比色测定吸光度.查标准曲线,即可计算出所测样品中还原糖的含量。

材料、仪器设备及试剂

(一)材料

      新鲜植物样品或烘干粉碎过的植物样品。

(二)仪器设备

      分光光度计,分析天平(感量1/10 000),离心机,水浴锅,具塞刻度试管.刻度吸管,容量瓶.研钵。

(三)试剂

      (1) 斐林试剂A液:40g CuSO₄•5H₂0溶解于蒸馏水定容至1L。

      (2)斐林试剂B液:200g酒石酸钾钠(KNaC₄H₄O₆•5H₂0与150g NaOH溶于蒸馏水中,并定容至1 L。

      A、B两液分别贮存,使用前等体积混合。

      (3)0.1%葡萄糖标准液:取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g.加蒸馏水溶解,定容至100 mL。

      (4) 0.1N NaOH。

      (5)甲基红指示剂:0.1g甲基红溶于250ml.60%乙醇中。

      (6) 10% Pb( Ac)₂。

      (7)饱和Na₂SO₄。

实验步骤

1.标准曲线的制作

      取7支试管,按表1分别加入各溶液。

      将以上务管混合后加塞，于沸水浴中加热15 min。取出后自来水冷却，1 500 r/min离心15 mnin。 取上清液,用分光光度计在590 nn波长下比色,以蒸馏水作对照,读取吸光度。用空白管的吸光度与不同浓度锴的各管的吸光度之差为横坐标,对应的糖含量为纵坐标,绘制标准曲线。

2.样品中还原糖的提取

      取新鲜的植物样站洗净.擦干、剪碎,称取10.00g,放人研钵中研磨至糊状，用水洗人250 mL容量瓶中。当体积近150 ml,左右时,加2-3滴甲基红指示剂，如呈红色,可用0.1 mol/L的NaOH中和至微黄色。若用风于样品，可称取干粉3.00g,先在烧杯中用少量水湿润,然后用水洗入250mL容量瓶中,如显酸性.可用上法中和。

表1 还原性精测定时绘制标准曲线的试剂量
试剂	管号
	0	1	2	3	4	5	6
0.1%葡萄糖标准液/mL	0	1	2	3	4	5	6
蒸馏水/mL	6	5	4	3	2	1	0
每管含葡萄糖/mL	0	1	2	3	4	5	6
斐林试剂/mL	4	4	4	4	4	4	4
吸光度
吸光度差

      将容量瓶置于80℃的恒温水浴中保温30min,其间摇动数次，以便将还原糖充分提取出来。对含蛋白质较多的样品,此间可加10% PBb(Ac)₂.除去蛋白质,至不再产生白色跟状沉淀时,加饱和Na₂SO₄除去多余的铅离子。30 min后取出冷却,定容至刻度.摇勾后过滤待测。

3.样品测定

      吸取6mL待测液,加4mL斐林试剂,其他操作与标准曲线相同，在590nm波长下读取吸光度。以不含样品的空白臂的吸光度减去样品管的吸光度.在标.准曲线上查出糖含量。

结果计算

      按下式计算还原糖的百分含量。