在正常环境条件下生长的植物,体内游离脯氨酸的含量较低;但在逆境,如干旱、寒害、热害、盐碱胁迫等条件下,植物体内游离脯氨酸(proline,Pro)的含量可显著增加。脯氨酸亲水性极强,能稳定原生质体及组织内的代谢过程。因此,有人提出游离脯氨酸的含量作为植物抗逆性的指标。本实验要求掌握脯氨酸标准曲线的制作,植物体内游离脯氨酸提取及含量测定的方法,了解植物在逆境下脯氨酸含量的变化规律 。

富含脯氨酸的李子

原理

    植物体内的游离脯氨酸可以用磺基水杨酸或酒精提取。在酸性条件下,脯氨酸可与茚三酮加热后反应生成稳定的红色产物(此红色产物有互变异构体,其结构如下),520nm波长是其最大吸收峰。产物用甲苯萃取后,在该波长下,A值(吸光度)与溶液中红色产物的含量成正比。因此可以通过标准曲线查出或用回归方程计算出样品脯氨酸的含量。

脯氨酸异构体

试剂

(1).酸性茚三酮:称取2.5g茚三酮,加入60mL冰醋酸和40mL 2mol·L-1 H3PO4,于70℃下加热溶解,冷却后贮于棕色试剂瓶中备用,4℃下2-3d内有效。
(2).脯氨酸标准溶液:称取0.025g脯氨酸,溶解在250mL蒸馏水中,其浓度为100μg·mL-1。再取此液10mL,用蒸馏水稀释至100mL,即为10μg·mL-1之脯氨酸标准液。
(3).冰醋酸。
(4).甲苯。
(5).3%的磺基水杨酸溶液。

方法步骤

(1).标准曲线的制作:取7支25mL具塞试管,编号。按下表向各试管加入试剂,摇匀后,沸水浴30min,冷却,各加5.0mL甲苯,充分摇匀萃取。避光静置2-3h。待完全分层后,用吸管吸取甲苯层,用分光光度计以1号标准曲线试管作为空白调零,在520nm波长下测定吸光度。以脯氨酸含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。同时可以使用回归法求得回归直线。

试剂 标准曲线
1 2 3 4 5 6 7
标准Pro/mL 0.0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
水/mL 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0
冰乙酸/mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
茚三酮/mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Pro含量/(μg·mL-1) 0 2 4 8 12 16 20
A520

(2)样品游离脯氨酸提取:植物体内的游离氨基酸可以用80%的乙醇或3%磺基水杨酸提取。
①酒精提取:取正常供水及干旱条件下小麦功能叶片,装入塑料袋内,迅速带回实验室。称取0.1〜1.01 g新鲜样品两份,一份烘干测干重,另一份用于脯氨酸测定,样品放入研钵中,加入80%的乙醇及少许石英砂,研成匀浆,移入具塞试管中,加塞浸提1 h以上,然后按0.25:10 (质量浓度)的比例加入活性炭粉末,震荡后过滤于蒸发皿内,用80%的乙醇冲洗试管和残渣3 次。滤液于 80〜85℃水浴中蒸去乙醇,残液用蒸馏水定容至50 mL(或25 mL,以脯氨酸的含量而定)。取提取液10 mL于具塞试管中,加入1 g人造沸石强烈震荡,然后滤去人造沸石(碱性氨基酸对脯氨酸测定有干扰,被人造沸石吸附而除去)。滤液待测。
②磺基水杨酸提取:采样和称样与酒精相同。将称好的样品放入具塞试管中,加入5 mL 3%的磺基水杨酸溶液,加盖,将试管浸入沸水浴中提取15 min过滤,滤液待测。

(3)样品的测定:每个样品滤液设3个重复,在试管中加滤液0.5 mL,水1.5 mL,其后各加入冰乙酸2.0 mL和茚三酮2.0 mL,摇匀后沸水浴30 min,冷却,各加5.0 mL甲苯,充分摇匀萃取(暗中静置 2〜3 h)。

试剂 正常供水 干旱胁迫
1 2 3 1 2 3
滤液/mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
水/mL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
冰乙酸/mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
茚三酮/mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
A520
Pro含量/(μg·mL-1)

结果计算

测定结果按下式计算:

计算公式

    式中,C:从标准曲线上查得的(或计算的)脯氨酸重量(μg);Vt:提取液总体积(mL);Vs:测定时取用提取液体积(mL);W:样品干重(g);106:将g换算为μg。

注意事项

(1).一般样品在胁迫24h即已表现脯氨酸含量显著增加,处理时间越长,则效果愈加显著。所以取样量应当随处理时间延长而减少,否则样品吸光值会超出标准曲线。
(2).配置的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定,因此必须现用现配;制作标准曲线的脯氨酸标准液也应当现用现配,不可将母液放置到4d后使用。

400-066-8286