过氧化物酶(peroxidase, POD)是植物体内普遍存在且活性较高的一种酶,该酶催化以H2O2为氧化剂的氧化还原反应,在氧化其他物质的同时,将H2O2还原为H20,用以清除细胞内的H2O2,是植物体内的保护酶之一 。

    此外POD与植物的呼吸作用、光合作用、生长素的氧化 以及木质素的形成等有关,其活性随植物生长发育进程以及环境条件的改变而变化。因此测定POD活性可以反映某一时期植物体内的代谢及抗逆性的变化。本文将会介绍过氧化物酶活性测定的原理、方法实验步骤。

过氧化物酶

原理

    在有H2O2存在时POD能催化多酚类芳香族物质氧化形成各种产物,如作用于愈创木酚(邻甲氧基苯酚)生成四邻甲氧基苯酚(棕红色产物,聚合物),该产物在470 nm处有特征吸收峰,且在一定范围内其颜色的深浅与产物的浓度成正比,因此可通过分光光度法进行间接测定POD活性。

POD测定原理公式

试剂

(1)0.1%愈创木酚
(2)0.18% H2O2:取30%H2O2 3ml,蒸馏水定量至500ml
(3)标准母液:吸取 5% K2Cr2O7 1.2ml和纯化的10%Co(NO32 溶液50ml,混合后加蒸馏水稀释7倍,即为每毫升相当于6.75μg四邻甲氧基苯酚标准母液

方法步骤

(1)标准曲线的制作:取20ml具塞试管6支,编号,按下表配制四邻甲氧基苯酚标准系列溶液,混匀后以1号管调零,于470 nm波长下测定吸光度,以标准液浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。或用计算器求出吸光度(Y)随标准液浓度(X)变化的线性回归方程。

试剂 试管号
1 2 3 4 5 6
标准母液/mL 0 1.25 2.50 5.00 7.50 10.00
蒸馏水/mL 10 8.75 7.50 5.00 2.50 0
标准系列含量/μg 0 8.4 16.9 33.8 50.6 67.5
A470

(2)POD的提取:取待测植物样品(如叶片等),剪碎混匀,称取0.5〜1.0 g于研钵中,加少量 石英砂、CaC03和适量蒸馏水,冰浴研磨匀浆,蒸馏水定最至50 mL,摇匀后离心,上清液即为待测酶液。

(3)POD活性测定:取20mL具塞试管6支,3支测定(3个重复),3支空白对照。各加入酶液1.0 mL,0.1%愈创木酚1.0 mL,蒸馏水6.9 mL,摇匀,加入0.18% H202 1.0 mL(空白管不加,多加1.0mL蒸馏水),摇匀(计时),25℃下准确反应10 min,加5%偏磷酸0.2 mL终止反应。用标准曲线1号管调零,于分光光度计上测定3支测定管和空白对照管的A470

计算公式

    式中,X为测定管四邻甲氧基苯酚的含量(mg);X0为对照四邻甲氧基苯酚的含量(μg);Vt为酶液总体积(mL);FW为样品鲜重(g);Vs为测定时取酶液的量(mL);t为酶作用的时间(min)。

400-066-8286