一、原理:

    植物细胞中的RNA包括rRNA、tRNA和mRNA。rRNA是含量最丰富的,占植物总RNA量的70%。tRNA在细胞中的含量也比较丰富,占15%。mRNA的含量较低,其大小、序列各异,长度从几百bp到几千bp不等,是基因转录、加工后的产物,反应了植物组织在某一时间点上的基因转录情况。纯化完整的RNA是进行基因表达研究和从cDNA文库克隆新基因的基础。

植物RNA提取

    因为核糖残基在2′和3′位带有羟基,所以RNA比DNA的化学性质更活泼,易于被RNA酶所降解。RNA酶是一种耐受性很强的酶,可抵抗长时间煮沸和温和变性剂,也不会被溶液中的金属螯合剂所失活。裂解后的植物细胞会释放出RNA酶,人的皮肤也是含有大量RNA酶。实验中使用的玻璃器皿、缓冲液,甚至操作台面和浮尘中都可能含有RNA酶。目前尚无使RNA酶失活的简易方法。所以,实验的每一步操作都应注意避免被RNA酶所污染。

二、仪器设备

1.灭菌锅。 2.通风橱。
3.冷冻离心机。 4.1.5mL离心管。
5.恒温水浴。 6.微量进样器及一次性枪头。
7.烘箱。 8.分析天平。
9.pH计。 10.一次性手套。
11.预冷的研钵。

三、试剂

    1.双蒸水。
    2.液氮。
    3.1mol•L-1 NaAc。
    4.提取缓冲液:50mmol•L-1 Tris-HCI,pH8.0,含10mmol•L-1 EDTA、0.5%SDS、100mmol•L-1 NaCI、4mol•L-1异硫氰酸胍、100mmol•L-1β-疏基乙醇(用前加入)。
    5.水饱和酚:氯仿:异戊醇=24:24:1(现用现配),pH8.0。
    6.氯仿:异戊醇=24:1。
    7.无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇。
    8.1:500(体积比)DEPC(焦炭酸二乙酯)。

溶液3和7配制时需加入1:500(体积比)EDPC后定容,在通风橱中放置2h,高压灭菌30min。用同样方法处理一定量双蒸水,用于清洗。含Tris的缓冲液用灭菌的双蒸水配制。

四、材料

小麦幼苗。

五、方法步骤

     1.实验准备:将所有玻璃器皿于180℃下干烤4h;所有离心管、枪头用0.1%DEPC(焦炭酸二乙酯)浸泡2h,再用灭菌的双蒸水(SDW)冲洗,最后高压灭菌30min。
    2.将新鲜小麦幼苗置研钵中,加入液氮研成细粉。加提取缓冲液浸提5min。每1.5mL离心管的适宜用量为0.2g材料,1.2mL提取缓冲液。
    3.12000g,4℃离心15min(以下离心操作均同此步)。
    4.加入1X体积的酚/氯仿/异戊醇振荡萃取,离心。
    5.取上清液,用1X体积的氯仿/异戊醇重复萃取、离心一次。如两相界面上仍有蛋白等杂质,则重复此步骤,直至界面清晰为止。
    6.用加样枪吸取上清转移至另一离心管中,同时量取体积。加1mol•L-1NaAc至终浓度为0.14mmol•L-1,混匀,加0.7X体积无水乙醇,4℃放置,可见白色RNA絮状沉淀。
    7.离心,用70%乙醇沉淀几次,每管用30-50μL双蒸水重悬浮沉淀用于检测。

六、注意事项

    1.人的唾液、汗液、皮肤表面有RNA酶,实验过程中要使用一次性手套。
    2.使用DEPC时必须戴口罩、手套,并在通风橱内进行。严禁DEPC接触皮肤。
    3.如果提取出的RNA经检测有DNA污染,可以加入DNA酶进行处理。
    4.本方法仅适用于幼嫩植物组织,不适用于淀粉含量高或次生物质含量高的植物材料。

 

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