紫外吸收光谱法

原理

     DNA在260nm处有一个明显的吸收峰。若吸收峰出现偏差,则说明样品有RNA或其他非核酸类杂志。对于较纯的样品,还可以通过260nm处的吸光度估测样品的浓度。

仪器设备

     紫外分光光度计,配石英比色杯,光程1cm。

植物DNA测定

试剂

TE缓冲液。

材料

     从植物组织中提取的DNA样品。

方法步骤

     1.取溶于TE缓冲液的DNA样品分别于260nm和280nm比色,测定吸光度,分别以A260和A280表示。正常值应为A260/A280=1.8+0.1。若存在偏差,则说明样品中有RNA或其他杂志。

    2.与200-300nm范围内扫描样品的紫外吸收光谱。DNA应在260nm处有明显的吸收峰。

    3.在1cm光程下,较纯的DNA可根据A260的估值来估测浓度:

植物DNA测定

DNA样品的琼脂凝胶电泳快速测定

原理

    琼脂凝胶可以构成一个直径从50-200nm的三维筛孔通道,可分离1-25kb范围内的DNA片段。在水平电场中,低电压时,DNA片段的迁移率与所用的电压成正比。DNA样品可通过溴化乙锭(EB)染色,在紫外灯下直接观察到荧光。

仪器设备

1.电泳设备一套:包括电源、水平电泳槽和梳子。
2.胶带。
3.恒温水浴或微波炉。
4.20μL加样枪或毛细滴管。
5.三角瓶。

试剂

1.电泳缓冲液:常用1xTAE或0.5xTBE。配方检附表1-1。一般配制5x或10x储存液,实验时稀释。
2.溴化乙锭(EB)贮存液:10mg•mL-1,温室避光保存。
3.琼脂糖溶胶:根据附表1-2确定琼脂糖溶胶的浓度。琼脂糖溶液的体积以倒入水平电泳槽3-5mm厚为宜。确定胶浓度和体积后,称取足量琼脂糖干粉,加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角瓶中,加盖(不要盖紧),置沸水浴中加热到琼脂糖融化,转移至55℃水浴。待温度平衡后,加入EB,使后者终浓度为0.5μg•mL-1。轻轻旋转混匀溶胶,置55℃水浴保温备用。
4.样品缓冲液:见附表1-3。使用何种样品缓冲液依个人习惯。
5.DNA标准样品(用于测定DNA相对分子质量):根据所分离DNA分子的大小,可选购高分子质量标准(1-20kb)或低分子质量标准(100-1000bp)。按说明书用样品缓冲液稀释后使用。

材料

     从植物组织中提取的DNA样品。

方法步骤

1.清洗电泳槽,用胶带将电泳槽模具开放的两边封起。
2.将55℃的琼脂糖溶液倒入电泳槽,至胶厚度为3-5mm,插上梳子。注意胶内及梳齿间不能出现气泡。
3.待胶凝固后,加少量电泳缓冲液于凝胶顶部,小心拔出梳子,倒出电泳缓冲液,撕去封边胶带,将凝胶安放到电泳槽内。
4.向电泳槽内加人电泳缓冲液,淹没凝胶约1mm。
5.混合DNA样品和0.2x体积样品缓冲液。
6.点样。分子质量标准样应在样品孔的左右两侧各点一个。
7.盖上电泳槽盖,施加1-5μ/cm电压进行电泳(其中距离以阳极至阴极之间的测量为准)。电泳至溴酚蓝迁移到适当距离即可用紫外灯进行检测。

注意事项

1.EB是较强的诱变剂,在配制、使用过程中不要接触皮肤。含EB的胶、缓冲液等用后应单独贮存,不可随意倾倒、丢弃。
2.点样量:应根据DNA样品浓度和样品孔的容积确定。一般宽度为5mm的DNA条带用EB染色后的最小检出量为2ng。如单孔DNA上样量超过500ng则会出现过载现象,造成条带拖尾、模糊不清。上样体积也不宜过大,应避免从加样孔溢出污染邻孔样品。
3.电泳时间:电泳过程中可以随时关闭电源用紫外灯检测DNA条带是否分开。达到实验要求后即可停止电泳,不必等待指示剂迁移至凝胶边缘。快速检测时,可将电压适当提高,将电泳时间控制在30min以内。但高压电对大片段DNA的分离效果不好。

附表

表1-1 几种常用的电泳缓冲液
缓冲液 工作液 储存液/L
TAE 1X 50X
242g Tris
40mmol•L-1 Tris-乙酸盐 57.1mL 冰乙酸
1mmol•L-1 EDTA 100mL0.5mol•L-1 EDTA(pH8.0)
TPE 1X 10X
108g Tris
90mmol•L-1 Tris-磷酸盐 15.5mL磷酸(85%,1.679g•mL-1)
2mmol•L-1 EDTA 40mL0.5mol•L-1 EDTA(pH8.0)
TBE 0.5X 5X
54g Tris
45mmol•L-1 Tris-硼酸盐 27.5g硼酸
1mmol•L-1 EDTA 20mL 0.5mol•L-1 EDTA(pH8.0)

 

表1-2 琼脂糖浓度与所分离DNA片段大小的关系
琼脂糖浓度/% DNA大小
0.5 700bp-25kb
0.8 500bp-15kb
1.0 250bp-12kb
1.2 150bp-6kb
1.5 80bp-4kb

 

表1-3 常用样品缓冲液配方(6X)
缓冲液类型 6X缓冲液(质量浓度) 储存温度
I 0.25%溴酚蓝 4℃
0.25%二甲苯氰FF
40%蔗糖水溶液

 

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