本文介绍了植物组织ATP酶活性的测定方法,包括ATP酶活性的测定原理,实验所需试剂,实验步骤以及实验注意事项。

原理

      ATP酶( adenosine triphosphatase)可催化ATP水解生成ADP及无机磷的反应,这一反应放出大量能量,以供生物体进行各种需能生命过程。它存在于生物细胞的多个部位,比如细胞质膜上、叶绿体类囊体膜上,对整个生命的维持有着重要的作用。在生物学研究中,常通过测定酶促反应释放的无机磷量或ATP的减少量以及pH变化等来测定ATP酶的活力。

      本实验通过测酶促反应过程中无机磷的释放量来测定叶绿体偶联因了AT-Pase的活力。偶联因子是分布在叶绿体类囊体膜表面的一-种复合蛋白,它在光合作用能量转换反应中起重要作用。在正常情况下,膜上的偶联因子催化光合磷酸化反应( ATP合成)的速率很高,而水解ATP的活力是十分低的,但用二硫苏糖醇(DTT)、胰蛋白酶或较高温度等激活后,它水解ATP的活力可大大增加。因此,偶联因子的测定常用激活后的ATPase水解ATP的活力来表示。

材料、仪器设备及试剂

(一)材料

      新鲜菠菜10g,洗净,去叶柄和中脉备用。

(二)仪器设备

      分光光度计,水浴锅,照光设备(光源50000 1x),台式离心机。

(三)试剂

      (1)Tris-HCl缓冲液1 mol/L(pH 8.0):称60.57 g Tris 溶于400 mL蒸馏水中,用浓盐酸调至pH8.0,再加蒸馏水至500mL。

      (2)5 mol/L硫酸溶液:取27.8 mL(比重1.84)浓硫酸,慢慢加人到70 mL蒸馏水中,冷却后定容至100 mL。

      (3)10%硫酸一钼酸铵溶液:称10g钼酸铵溶于100mL 5mal/L硫酸中。

      (4)硫酸亚铁-钼酸铵试剂:称5 g硫酸亚铁,加入10 mL硫酸-钼酸铵,再加蒸馏水稀释到70mL,直至溶解为止(用前临时配制)。

      (5)STN缓冲液:将0.05 mol/L Tris-HCl pH 7.8缓冲液(内含0.4 mol/L蔗糖,0.01 mol/L NaCl)放人冰箱中倾冷。

实验步骤

(一)叶绿体制备及叶绿素含量测定

      取准备好的菠菜叶5g,置于研钵或组织捣碎机杯中,加人20mL 0℃下预冷的STN缓冲液,很快研磨或捣碎(0.5min完成),作成匀浆,以四层纱布过滤去粗渣,滤液于0~2℃下,200x g离心约1min,去细胞碎片,将上清液再于1500x g离心5~7 min,取沉淀悬浮于少量STN(pH 7.8)中,使叶绿素含量在0.5 mg/mL左右。小麦、水稻均可以此介质制备叶绿体。如以甜菜叶子作材料,则匀浆介质中还应加人0.02 mol/L抗坏血酸钠。--般取0.1 mL叶绿体,加0.9 mL水和4mL丙酮(分析纯),离心,取上清液于652 nm测吸光度,按Amon公式计算:

ATP酶活性测定计算公式

(二)ATP酶的激活

      (1)Mg2+一ATP酶激活液及反应液配制(见表1)。

表1 Mg2+—ATP激活液和反应液的配制
试剂 激活液/mL 试剂 反应液/mL
0.25 mol/L Tris—HCI,pH8.0 0.2 0.5 mol/L Tris—HCI,pH8.0 0.1
0.5 mol/L HaCI 0.2 0.05 mol/L MgCI2 0.1
0.05 mol/L MgCI2 0.2 50 mmol/L ATP 0.1
50 mmol/L DTT 0.2   H2O 0.2
0.5 mol/L PMS 0.2     0.5
    0.1      

      (2)激活过程:取已制备好的叶绿体悬浮液1mL(叶绿素含量约为0.1mg/mI),加入1mL激活液,于室温在白炽光50000lx下进行光激活6min。

      (3)反应过程:取兰只试管,分别加入上述激活后的叶绿体悬浮液各0.5 mL(剩下的叶绿体悬浮液供测定叶绿素含量时用),再加人0.5mL的反应液,取两管置37C水裕中(另一管置冰浴中作空白用)保温10 min,各加入0.1 mL 20%的三氯乙酸停止反应。用台式离心机离心后各取上清液0.3~0.5 mL(取样量按活力大小而改变),供测定ATP水解的无机磷用。

      (4) Ca+2 - ATP酶的激活和激活液及反应液的配制(见表2)。

表2 Ca2+—ATP酶激活液和反应液的配制
试剂 激活液/mL 试剂 反应液/mL
0.25 mol/L Tris—HCI,pH8.0 0.2 0.5 mol/L Tris—HCI,pH8.0 0.1
20m mol/L EDTA•Na2 0.2 50m mol/L ATP 0.1
10 mmol/L ATP 0.2   H2O 0.2
2mg/mL 胰蛋白酶 0.2 0.05 mol/L CaCI2 0.1
  H2O 0.2     0.5
    0.1      

      (5)激活过程:取已制备好的叶绿体恳浮液1 mL,加人1 mL激活液,置20水浴中保温激活10min,加入牛血清蛋白(10mg/mL)0.1mL停止激活。

      (6)反应过程:与Mg2+-ATP酶的反应过程相同。

      (7)热处理激活:将叶绿体悬浮在1 mL含Tris - HCI( pH 8.0)20 mmol/L、DTT5 mmol/L、ATP 20 mmol/L的激活液中,置水浴中64℃保温4 min,于自来水冷却后按Mg2+-ATP酶反应过程进行分析。

(三)无机磷的测定

      取反应后经离心的上清液0.5mL加人2.5mL蒸馏水,摇匀后加人2mL硫酸亚铁一钥酸铵试剂,于室温放置1min后显色即稳定,置分光光度计上用660nm比色测定吸光度。

结果计算

       ATP酶活力的计算。按表3配制不同浓度的无机磷标准溶液,于分光光度计.上用660nm测定吸光度。以尤机磷浓度作横坐标,所测得的吸光度作纵坐标绘制标准曲线,按下式计算ATP酶活力:

ATP酶活性测定计算公式

      式中:C为从标准曲线上查得的无机磷含最,μmol/mL;VT为反应体积,mL;W为叶绿素的质量,mg;Vs为测定时取用体积,mL;t为反应时间,min。

      新鲜菠菜10g,洗净,去叶柄和中脉备用。

表3 不同浓度的无机磷酸盐的配制
溶液/mL 无机磷浓度(umol•mL-1
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
0.001mol/L Na2 HPO4 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
H2O 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4
20%三氯乙酸 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
硫酸亚铁-钼酸铵试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

 

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