PG、PE是与果实软化相关的酶类。在果实采后贮藏过程中,该类酶活性的变化与果肉细胞壁结构的变化密切相关,进而影响到果实的硬度变化。测定酶活性对揭示果实采后软化机理具有重要意义。

果实成熟

1.原理

    果胶由原果胶(protopectin)、果胶酯酶(pectinic acid)和果胶酸(pectic acid)组成。因此,降解果胶的果胶酶按其催化的反应部位不同,可分为果胶酯酶(PE)和多聚半乳糖醛酸酶(PG)两种。PE催化果胶酯酸分解生成果胶酸和甲醇,可用NaOH滴定生成的果胶酸来表示PE活力。PG催化果胶酸分解生成半乳糖醛酸。后者的醛基具有还原性,可用亚碘酸定量测定,以产生半乳糖醛酸的量来表示PG活性。

2.试剂

(1).液氮。
(2).酶提取液:1.0 mol·L-1 NaCl溶液,内含4 mol·L-1 β-巯基乙醇。
(3).75%(NH42SO4 溶液。
(4).0.2 mol·L-1 pH 6.0 HAc-NaAc缓冲液。
(5).1% 果胶溶液:称取果胶粉1g 于250mL 烧杯中,加入100mL 0.5% NaCl溶液,加热溶解,过滤、冷却,蒸馏水定容至100mL。
(6).中性红溶液:称取0.5g中性红,用75%乙醇溶液100mL 溶解。
(7).0.05 mol·L-1 NaOH溶液。
(8).0.1% 多聚半乳糖醛酸。
(9).1 mol·L-1 Na2CO3溶液。
(10).0.1 mol·L-1 I2-KI溶液:称2.5g KI溶于10 mL 水中,另取1.27g I2溶于KI溶液中,待I2全部溶解后定容到100mL,贮存与棕色试剂瓶中。
(11).1 mol·L-1 H2SO4
(12).0.05 mol·L-1 NaS2O3溶液。
(13).5%淀粉溶液。

3.方法步骤

3.1.粗酶液的制备

(1).取样品5.0g在液氮中研磨成干粉,加入提取液20mL,搅拌均匀,调pH至6.0。冰浴中静置提取2h。
(2).5000g离心10min。
(3).取上清,用75%(NH42SO4沉淀蛋白,冰浴放置1h。
(4).依上法再离心一次,沉淀悬浮于0.2 mol·L-1 pH 6.0 HAc-NaAc缓冲液中,冰箱中透析过夜,得到酶的粗提液。

3.2.PE酶活性测定

(1).取20 mL 1%果胶溶液,置100mL 锥形瓶中,加入2滴中性红溶液,用0.05 mol·L-1 NaOH 溶液滴定至红色消失。
(2).加入 1mL pH 7.0 酶液,立即记时,并将锥形瓶放入30℃水浴中,摇动。待红色出现后,用0.05 mol·L-1 NaOH溶液滴定至无色。
(3).重复保温、滴定,记录30min内滴加的NaOH总量。
(4).结果计算:以每mL酶液1min内释放1mmol CH3O为1个酶活力单位U。

PE酶活性测定公式

式中,0.05:NaOH的摩尔浓度;V1:消耗NaOH的mL数;V2:反应系统内加入酶液的体积(mL);t:酶促反应时间(h)。

3.3.PG酶活性测定

(1).取250mL 锥形瓶4个,各加入10mL pH3.5酶液,其中两瓶置沸水浴中钝化5min,作为空白对照。
(2).在4个锥形瓶中各加入10mL pH3.5的1%果胶溶液,置50℃水浴中保温2h。
(3).反应结束后,将2个含活酶液的锥形瓶在沸水浴中加热5min终止反应,冷却至室温。
(4).向每瓶加入5mL 1 mol·L-1 Na2CO3溶液,20mL 0.1 mol·L-1 I2-KI溶液,摇匀,加塞,暗中放置20min。
(5).反应结束后,向每瓶中加入10mL 1 mol·L-1 H2SO4。用0.05 mol·L-1 NaS2O3溶液滴定至淡黄色,加3滴5%淀粉溶液,再滴定至蓝色消失。
(6).结果计算:以每毫升酶液1h内催化产生1 mmol 游离半乳糖醛酸作为1个酶活力单位U。

PG酶活性测定公式

式中,A、B:样品和对照消耗NaS2O3的体积(mL);m:NaS2O3的摩尔浓度;E:反应系统内加入酶液的体积(mL);t:酶促反应时间(h);0.51:1 mmol NaS2O3相当于0.51 mmol游离半乳糖醛酸。

5.注意事项

注意酶反应的最适pH。

400-066-8286