苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninammo-nialyase ,PAL)是植物体内苯丙烷代谢途径的关键酶,其活性高低控制着植物体内多种次生酚类化合物、类黄酮植保素、木质素等抗菌物质的合成,因此PAL在植物的次生代谢和抗病代谢中具有重要作用。本文将会介绍紫外分光光度法测定PAL活性的原理和方法。

植物抗逆研究

1.原理

    PAL催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸,反式肉桂酸在290nm处有强吸收峰,因此可通过测定反应液A290值的变化计算PAL活性。

测定原理图

    苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸的脱氨反应,生成反式肉桂酸。根据反式肉桂酸在290nm处吸光度的变化可以测定该酶的活性。

2.仪器设备

(1)紫外分光光度计 (2)高速冷冻离心机
(3)研钵 (4)移液管:0.5mL 1支,1 mL 3支,2 mL 1支,5 mL 1支
(5)试管:10 mL 5支 (6)恒温水浴

3.试剂

(1)0.1 mol·L-1 硼酸缓冲液,pH8.8。
(2)0.02 mol·L-1 L-苯丙氨酸(用pH8.8硼酸缓冲液配制)。
(3)提取介质:内含0.05mol·L-1 硼酸缓冲液、5.0 mmol·L-1巯基乙醇、1.0 mmol·L-1 EDTA-Na2、5%甘油pH8.3;5%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。
(4)6 mol·L-1 HCl。

4.材料

    正常生长或经诱导处理的水稻、小麦叶片(或黄化幼苗)、马铃薯块茎等植物新鲜组织。

5.方法步骤

(1)PAL的提取:取待测植物样品1-2g,-15℃冷冻固定后于研钵中加少量的提取介质、少量石英砂,冰浴研磨匀浆,最后用提取介质定容到10 mL,搅拌均匀,4层纱布过滤,滤液在4℃下 10000 r/min 离心15min,上清液即为待测酶液,4℃保存备用。
(2)PAL酶活性测定:取4支10mL试管(3支测定管,1支对照管),分别加入0.02 mol·L-1 L-苯丙氨酸1.0 mL(对照管不加,代之为蒸馏水),硼酸缓冲液(pH8.8)2.0mL,酶液1.0mL(根据酶活性适当稀释或增加体积),总体积4.0mL。摇匀后置30℃恒温水浴保温60min,加0.2mL 6 mol·L-1 HCl终止反应,若有沉淀需过滤或离心。用对照管调零,在290 nm处检测测定管反应液的吸光度A290.
(3)以测定管反应液每小时A290增加0.01为一个酶活性单位(U):

计算公式

    式中,Vt:酶液总体积(mL);FW:样品鲜重(g);Vs:测定时取酶液的量(mL);v:反应液总体积(mL);t:反应时间(h)

6.注意事项

(1)PAL属于诱导酶,受光(如红光)、受伤、病害感染等诱导活性增高
(2)除直接用新鲜材料提取的酶液测定外,也可将酶液用冷丙酮制成丙酮粉(可较长时间保存),然后用缓冲液溶解测定。

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