硝酸还原酶

1.原理

    硝酸还原酶是植物氮素同化的关键酶,也是一种诱导酶,与作物吸收和利用氮肥有关,可催化硝酸盐还原为亚硝酸盐:

硝酸还原酶测定原理

    产生的NO2-在酸性条件下可以与对氨基苯磺酸(sulfanilic acid)或磺胺(对氨基苯磺酰胺,sulfanil-amide)反应生成重氮盐,再与α-萘胺反应生成红色偶氮化合物(对苯磺酸偶氮-α-萘胺)。

    生成的红色偶氮化合物在520 nm波长下有最大吸收值,可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可以每小时每克鲜重产生的NO2- μg 数表示酶活性(NO2- μg·g-1FW·h-1)。

    根据材料处理不同可分为活体法与离体法,根据反应介质的不同则可分为内源基质法和外源基质法。活体法步骤简单,适合快速、多组测定。离体法复杂,但重复性较好。内源基质法测定结果可反映硝酸还原酶在实际生长条件下的还原力,而外源基质法测定结果则可反映硝酸还原酶的潜在或最高还原力。下面介绍活体法的具体实验步骤。

2.试剂

(1).0.1 mol·L-1 pH7.5磷酸缓冲液:Na2HPO4·12H2O取30.0905g与Na2HPO4·2H2O取2.4965g,用蒸馏水定容至1000 mL。
(2).30%的三氯乙酸:30g三氯乙酸,蒸馏水溶后定容至100mL。
(3).0.2 mol·L-1 KNO3:20.22g KNO3用蒸馏水定容至1000 mL。
(4).磺胺试剂:1g 磺胺,加25mL 浓盐酸,用蒸馏水定容至100mL。
(5).α-萘胺试剂:0.2g α-萘胺,用含1 mL浓盐酸的蒸馏水定容至100mL。
(6).5 μg·mL-1 NO2-1标准液:0.10g NaNO2用蒸馏水定容至100mL,吸取7.5mL,再用蒸馏水定容至1000mL。

3.材料

欲测植物材料(如叶菜类蔬菜,实验材料在实验前一天可用硝态氮肥处理,以增强硝酸还原酶活性)。

3.方法步骤

(1)标准曲线制作:取7支15mL 刻度试管,按下表顺序添加试剂。

试管编号 1 2 3 4 5 6 7
5 μg·mL-1 NO2-1标准液/mL 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
蒸馏水/mL 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0
每个试管中NO2-1含量/(μg·mL-1 0 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
磺胺及α-萘胺 每管加磺胺试剂2mL,α-萘胺试剂2mL,然后静置30min
520 nm比色,吸光度(A)
回归曲线

(2)取新鲜植物组织洗净,拭干。如果是叶片可去主脉,打成直径1cm的圆片,若是根、茎可切成0.1cm厚的薄片。
(3)取上述材料4份,每份50片,称重后分别放入4个50mL三角瓶中,其中1个为空白,3个用于酶活性测定,分别记为重复1、2、3。
(4)在空白瓶中先加1mL 30%三氯乙酸,然后在每个三角瓶中加入0.1 mol·L-1 pH 7.5 磷酸缓冲液5mL、蒸馏水5mL(内源基质法)。如果是外源基质法,则将蒸馏水换为5mL 0.2 mol·L-1 KNO3。
(5)将三角瓶置于真空干燥器中抽气至样品完全沉入溶液中(约10min)。
(6)取出三角瓶,30℃避光30min;之后在重复中也分别加入1mL 30%的三氯乙酸以终止反应,摇匀。
(7)吸取2mL(若反应液浓度太大,可吸取1mL 加 1mL水)反应液于10mL试管中,加磺胺试剂2mL,α-萘胺试剂2mL,静置30min;比色,记下吸光度(A);

实验结果
空白 重复1 重复2 重复3
鲜重
吸光度(A)
NO2-含量C/(μg·mL-1
酶活性/(μg NO2-·g-1 FW·h-1
平均值

4.结果计算

从标准曲线中检出NO2-含量(μg·mL-1),以每小时每克鲜重产生的NO2-·μg数表示酶活性,计算方法:

硝酸还原酶测定计算

式中,C:根据回归曲线计算的NO2- μg数;Vt:反应液总体积(mL);Vs:测定时取样体积(mL);FW:鲜重(g);t:反应时间(h)。计算时,先分别计算3个重复的结果,再算平均值,为所求结果。

400-066-8286