本实验以异丙醇-水-盐酸提取植物样品内源性激素（Endogenous Phytohormones），以安捷伦（Agilent）1290高效液相色谱仪串联AB Sciex QTRAP 6500+质谱仪测定植物内源性激素含量，并在提取过程中加入内标物质校正检测结果。
1、内源性激素检测概要
1.1物质提取和分离
植物内源激素是植物自身合成的、对植物生长发育起重要调控作用的物质。由于其本身含量较低，而又参与调控了植物的整个生长过程，因此准确检测植物激素在植物内的浓度变化以及组织特异性分布，是了解其代谢途径和运输过程的重要前提。
为提取常规酸碱性激素，本实验采用异丙醇/水/盐酸溶液的方法，通过提取液加酸提高激素在有机溶剂中溶解性并钝化组织中的部分酶。而后通过二氯甲烷萃取并以氮气吹扫方式浓缩样品，该方法流程相对简单，待测物损失较小，同时由于Qtrap6500仪器的灵敏性，不需过多繁琐的净化步骤即可准确检测大部分痕量待测物。
1.2液相色谱串联质谱检测
本实验使用AB公司Qtrap6500质谱仪，此质谱仪的质量分析器为三重四级杆-离子肼模式。采用ESI-HPLC-MS/MS方法对植物激素进行定量分析。以安捷伦1290高效液相色谱仪分离样品物质，以电喷雾电离(ESI)为离子源，经多通道检测（MRM）模式扫描。即同时进行多个SIM（选择离子监测）模式扫描。该模式常用于对目标化合物检测，灵敏度高，但缺乏进一步的物质结构信息。其原理是质量分析器（Q1）特异性选择母离子（parent ion）后，在碰撞反应室（Q2）将母离子通过碰撞诱导解离（collision-induceddissociation, CID）使这一离子裂解生成子离子（daughter ions），在Q3选择子离子，并对其信号进行检测。对于大多数激素我们都会检测2到3个子离子，并取其中一个（通常为响应值较高的）作为定量离子。其余子离子作为定性离子。以目标物质在样品及标准品中的出峰时间，以及目标物质各子离子之前的比值在样品及标准品中的比值确定样品中的待测物。并通过线性回归方程拟合对待测物定量
1.3主要实验仪器
台式高速离心机 AR5120电子天平 Aglient1290高效液相色谱仪 AB SCIEX-6500Qtrap(MS/MS)
UYC-200全温培养摇床 氮吹仪
2、实验步骤
2.1 样品提取流程
（1）取出超低温保存样本，于液氮中研磨至干粉状，称取适量新鲜植物样品于玻璃试管中；
（2）向玻璃试管中加入异丙醇-水-盐酸混合提取液；
（3）添加8µL 1µg/mL的内标溶液，低温振荡30 min；
（4）加入二氯甲烷，低温振荡30 min；
（5）低温，13000 r/min离心5 min，取下层有机相；
（6）避光，以氮气吹干有机相，以甲醇（0.1%甲酸）复溶；
（7）4℃离心10min（13000g），取上清液过0.22µm滤膜，HPLC-MS/MS检测。
注：植物激素不稳定，提取过程应全程保持在4℃冰盒上操作。
2.2 标准溶液配制
以甲醇（0.1%甲酸）为溶剂配制梯度为0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，200ng/mL的SA、JA、MESA标准溶液，并加入终浓度为20ng/mL的内标溶液，在实际绘制标准曲线方程时剔除线性异常点。
2.3 色谱质谱检测条件
数据采集系统主要包括高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC） （Agilent 1290，https://www.agilent.com/）和串联质谱（Tandem mass spectrometry，MS/MS ）（Applied Biosystems 6500 Quadrupole Trap，https://sciex.com.cn/）。
2.4 定性定量分析
利用软件Analyst处理质谱数据。下图所示为样本的总离子流图（Total ions current，TIC）即每个时间点质谱图中所有离子的强度加和后连续描绘得到的图谱，下图所示为植物激素检测总离子流图，横坐标为植物激素检测的保留时间（Retention time，Rt），纵坐标为离子检测的离子流强度（count per second，cps）
总离子流图
| 物质类别 | 物质名称 | 极性 | 母离子（m/z） | 定量离子（m/z） | 定性离子（m/z） | 解簇电压(V) | 碰撞能量（V） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| SA | SA | - | 137.0 | 92.9 | 65.0 | -50 | -20/-39 |
| MeSA | - | 153.0 | 93.1 | 121.0 | -131 | -24/-39 | |
| JA | JA | - | 209.2 | 58.9 | 58.9 | -54 | -16 |
植物激素质子化或去质子化的选择反应监测条件([M+H]+or[M-H]-)
3、实验结果与分析
3.1 部分标准曲线展示
MESA校准曲线
SA校准曲线
3.2 部分方法学验证数据
| 物质类别 | 物质名称 | 线性范围（ng/mL） | 校正曲线 | 相关系数r | 权重 |
|---|---|---|---|---|---|
| JA | JA | 0.1-200 | y = 0.853 x + 0.00152 | (r = 0.9958) | 1/x2 |
| SA | SA | 0.1-200 | y = 1.88 x + 0.0298 | (r = 0.9977) | 1/x2 |
| MESA | 0.1-200 | y = 9.98 x + 0.0249 | (r = 0.9975) | 1/x2 |
物质类别、名称、线性范围、方程、相关系数和权重系数