1)游离脂(solvent extractable lipids)的提取
取12 g 土壤样品和 1-5 g 植物样品,首先加入重蒸水超声处理 15 分钟溶解土壤和植物样品中的水溶性极性化合物,然后离心,收集上层清夜,再重复1 次处理过程。将离心后的土壤与植物剩余物进行冷冻干燥去除残余水分。干燥后的土壤与植物剩余物分别用 30 ml 二氯甲烷溶液、二氯甲烷/甲醇混合溶液(1:1,v/v)和甲醇溶液超声提取 15 分钟 3 次,离心,合并所有提取的溶液用玻璃纤维滤膜(Whatman GF/A)过滤。过滤后的溶液通过旋转蒸发进行浓缩后,移入 2 ml 玻璃瓶中并在氮气下吹干(25 ℃)。吹干后的剩余物质即为提取的游离脂,称重(差量法)后,用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)进行定性和定量测定。提取游离脂后的剩余土壤和植物样品风干后储存在-20 ℃冰箱中供碱水解,提取酯结合的脂类物质。
2)酯结合的脂类物质的提取(碱水解法)
称取一定量的第一步剩余的土壤或和植物样品,将提取游离脂后的剩余土壤和植物样品放入 1 M 甲醇化氢氧化钾溶液中,循环加热回流 3 小时(温度 70 ℃),待冷却后,离心(30min/2500 r)取上清液,然后储存在 4 ℃冰箱中。剩余土壤和植物样品中再加入二氯甲烷/甲醇混合溶液(1∶1,v/v),超声波提取两次并离心,两次的液体过滤后与上一步滤液合并。使用 6 mol/l 的稀盐酸将所得滤液的 pH 调至 1.0,使用旋转蒸发仪去除有机溶剂后,加入50 ml的去离子水,然后再加入二氯甲烷进行萃取,这样就分离出酯结合的脂类物质。分离后的二氯甲烷中再加入无水硫酸钠去除水分,旋转蒸发进行超浓缩后,转移到 2 ml 玻璃瓶中,在N2 下吹干,称重,吹干后的剩余物质即为提取的结合脂。
3)气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)分析 检测仪器:TRACE 1600-ISQ7610气质联用仪 (GC-MS)
所有的提取物用 1 ml 二氯甲烷/甲醇溶液(1∶1,v/v)溶解,在 25 ℃下氮气吹干,通过与 90 ul 三氟乙酰胺(N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide,BSTFA)和 10 ul 氮苯(pyridine)在 70 ℃下反应 3 h,转换为三甲基硅烷基(trimethylsilyl,TMS)衍生物。待冷却后,加入 900 ul 正己烷稀释,然后用 GC/MS(TRACE 1600-ISQ7610气质联用仪)分析化合物的组成和丰度。采用 DB-5MS UI(Agilent,J&W Scientific,30 mx0.25 mmx0.25 μm)柱子,进样口温度 250 ℃,分流比 10:1,载气为高纯氦气,流速为1 ml/min,升温程序为 65 ℃ 保持 2 min,以 6 ℃/min 涨至 300 ℃保持 20 min。离子源温度 250 ℃,接口温度 280 ℃,溶剂切除时间 3 min,扫描 50-650 m/z。通过比较 TIC 峰面积与外部标准的峰面积来实现单个化合物的定量(或内标法)。所有样品中化合物单体的含量以 mg/g 有机碳表示。
4)植物性碳的降解特征
角质素与软木脂类脂质化合物的降解特征分析采用以下公式:
①C18 ω-羟基烃酸与所有C18羟基酸化合物含量之比:ω-C18/∑C18
(∑C18=C18 ω-羟基烃酸+C18 α、ω-烷二酸+C18 中长链取代酸)比值不断升高,代表植物脂类化合物在土壤中逐步被分解;
②软木脂和角质素之和:∑SC=∑S+∑C+∑SvC
(∑S= Suberin软木脂,∑C= Cutin角质素,∑SvC= Both in cutin and suberin)。
③RLS——长链(>C20烷酸)与短链(<C20)烷酸比值
④总软木脂∑S=C20~C32 ω-羟基烷酸+C20~C32 α,ω二酸+9,10-C18 环氧二酸;
⑤总角质∑C=C14、C15、C17中链取代羟基酸+C16中链取代单、二羟基酸和二酸
⑥总木脂质或角质∑SṿC=C16,C18 ω-羟基烷酸+ω C18二羟基和三羟基酸+9,10-C18 环氧羟基酸+C16,C18 α,ω二酸
⑦S/C--(∑S+∑SṿC)/(∑C+∑SṿC)
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