蔗糖作为植物体内主要的光合产物和运输物质,其代谢强弱对许多生理活动都会产生显著影响.而转化酶则是催化蔗糖降解的重要酶类,测定转化酶活性对了解光合产物的贮存、转运及累积都有重要意义。

蔗糖转化酶

原理:

      转化酶催化蔗糖的水解反应:蔗糖+H2O—►葡萄糖+果糖。

      根据催化反应所需的最适PH,可将转化酶进一步分为两种,一种称为酸性转化酶,其催化反应的最适pH为4.0〜5.5,主要分布在液泡和细胞壁中,另一类转化酶称为碱性或中性转化酶.其最适pH为7.0〜8.0,主要分布在细胞质中。

      蔗糖是非还原糖,水解后的产物葡萄糖和果糖都是还原糖,因此可测定水解生成的还原糖的量来表示酶活性的大小。还原糖在碱性条件下与3,5-二硝基水杨酸试剂共热时,可将黄色的3,5-二硝基水杨酸还原为棕红色的氨基化合物。在一定范围内还原糖的量与反应液颜色深浅成正比。

试剂

(1).提取缓冲液
(2).透析缓冲液
(3).酶反应液:80mmol•L-1乙酸-K3PO4(pH4.7和pH7.0)缓冲液,内含50mmol•L-1蔗糖。
(4).葡萄糖标准液:1mg•mL-1
(5).3,5-二硝基水杨酸试剂

方法步骤:

(1).酶液制备
(2).酶反应:取3支5mL具塞试管,加入0.95mL反应液和50μL透析后的酶液,30℃水浴中反应10min,煮沸3min中止反应。用煮死酶液作对照。
(3).还原糖含量测定:往各反应试管中再加3,5-二硝基水杨酸试剂1mL,沸水浴5min,冷却至室温,于540nm比色测定生成的还原糖的量。
(4).标准曲线制作:取7支5mL具塞试管,并按下表加入各种试剂,按上述步骤3进行,测定其吸光度值。以吸光度值为纵坐标,葡萄糖含量为横坐标,绘制标准曲线,以计算反应生成的葡萄糖量。

试剂 试管号
1 2 3 4 5 6 7
蒸馏水/mL 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0
3,5-二硝基水杨酸/mL 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
葡萄糖含量/mg 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
A540

(5).结果计算:酶活力以mg葡萄糖•g-1FW•h-1表示。

维生素C

式中,C:从标准曲线查得的葡萄糖量(mg);FW:组织鲜重(g);t:反应时间(h);Vt:提取酶液总体积(mL);Vs:测定时取用酶液体积(mL);n:提取液测定中的稀释倍数。

400-066-8286