原理:

     淀粉性种子吸水萌动后,胚产生赤霉素。赤霉素被释放到糊粉层中诱导a-淀粉酶形成。由于赤霉素诱导提高了一-些水解酶,如β-1,3糖苷酶、蛋白酶、核糖核酸酶、a-淀粉酶等酶的活性,对种子萌发过程中的物质转化和器官建成具有重要意义。没有胚的种子由于不能产生赤霉素,胚乳中便没有a-淀粉酶。通过碘式法比色测定淀粉在酶催化反应过程中的消耗量,可以定量分析a-淀粉酶的活力。

仪器设备

1.分光光度计。 α-淀粉酶
2.恒温箱。
3.水浴锅。
4.刀片。
5.移液管。
6.烧杯。
7.青霉素小瓶。
8.镊子。
9.试管等。

试剂

1.1%次氯酸钠(NaCIO)溶液。
2.0.1%淀粉溶液:可溶性淀粉1g加蒸馏水50mL,沸水浴至淀粉完全溶解后,再加人KH2PO48.16g,待其溶解后定容至1000 mL。
3. 2X10-5mol•L-1赤霉素(GA3)溶液:6.8 mg GA3溶于少量95%乙醇中,再定容至1000 mL。
4. I2-KI溶液:0.600g KI和0.060g I2分别用少量0.05 mol•L-1 HCI溶解后混合,用0.05 mol•L-1 HCl定容至1 000 mL。
5. 10-3 mol•L-1乙酸缓冲液:10-3 mol/L NaAc溶液590 mL与10-3 mol•L-1乙酸溶液410 mL混合后,加入1g链霉素,摇匀。

材料

    成熟、饱满、大小一致的大麦或小麦籽粒。

方法步骤

    1.选取成熟、饱满、大小一致的大麦或小麦种子50粒,用刀片将每粒种子横切成有胚和无胚的两半,分别放人新配制的1%NaClO溶液中消毒15min,再取出用无菌水冲洗几次。在无菌条件下,吸胀48 h。

     2.将2X10-5 mol•L-1 GA3稀释为2X10-6 mol•L-1、2X10-7 mol•L-1、2X10-8 mol•L-1的溶液;将10-3 mol•L-1的乙酸缓冲液稀释1倍。

     3.取青霉素小瓶6个,编号,按下表加入溶液和材料:

瓶号 赤霉素溶液 乙酸缓冲液/mL 加入实验材料
浓度/(moL•L-1) 用量/mL
1 0 1 1 10个有胚种子
2 0 1 1 10个无胚种子
3 2x10-5 1 1 10个无胚种子
4 2x10-5 1 1 10个无胚种子
5 2x10-7 1 1 10个无胚种子
6 2x10-8 1 1 10个无胚种子

     4.将小瓶放进恒温箱中,在25℃下振荡培养24h。

    5.淀粉酶活力的测定

    (1)取6支试管编号,向各试管中加入1mL0.1%淀粉溶液,再从振荡培养后的小瓶中吸取0.2mL培养上清液加人到对应编号的试管中摇匀;

    (2)将试管置30℃恒温水浴中准确保温10min(保温时间最好经预备实验确定,以吸光度达0.4-0.6的反应时间为宜);

    (3)向各试管加入2 mL I2-KI溶液,用蒸馏水稀释至5 mL,充分摇匀。以蒸馏水作空白调零在580nm的波长下比色。

    6.结果:以赤霉素浓度的负对数为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。待测样品可用吸光度表示淀粉酶的相对活性。

注意事项

     将小瓶放进恒温箱时,假如无振荡器,应经常摇动。

400-066-8286