1.原理

    吲哚乙酸(IAA)在IAA氧化酶的作用下,被氧化破坏失去活性。植物体内IAA氧化酶活力的大小,对调节体内吲哚乙酸的水平,起着重要的作用,从而影响植物的生长。酶活力的大小可以破坏吲哚乙酸的速率表示之。吲哚乙酸的含量可以用比色法测定。

2.试剂

(1).20 mmol·L-1磷酸缓冲液,pH6.0
(2).1 mmol·L-1 2,4-二氯酚:称取二氯酚16.3mg,定容至100mL蒸馏水中。
(3).1 mmol·L-1 MnCl2:精确称取MnCl2·4H2O 19.8mg,定容至100mL蒸馏水中。
(4).1 mmol·L-1吲哚乙酸:称取IAA17.5mg 用少量乙醇溶解,然后将其倒于盛有约90mL蒸馏水的容量瓶中(100mL)稀释至刻度。
(5).吲哚乙酸试剂A(A或B任备其中之一,试剂B较试剂A灵敏):15mL 0.5mol·L-1 FeCl3,300mL浓H2SO4,500mL蒸馏水,使用前混合之即成,避光保存。用时1mL样品中加入试剂4mL。
(6).吲哚乙酸试剂B:10mL 0.5mol·L-1 FeCl3、500mL 35%过氯酸,使用前混合之即成,避光保存。用时1mL样品中加入试剂2mL。

3.方法步骤

(1).将大豆或绿豆种子于30℃温箱中萌发3〜4 d,选取生长一致的幼苗,除去子叶,留下胚轴作材料。
(2).取20株胚轴,称得重量,置研钵中,加入预冷的适量磷酸缓冲液,石英砂少许,置冰浴中研磨成匀浆。再按100 mg鲜重材料加1 mL提取液的比例,用磷酸缓冲液定容到10 mL 离心 (4000 r/min)20 min,所得上清液即为粗酶液.
(3).取试管4支,编号,在1〜3号试管中各加入MnCl2 1 mL,2,4-二氯酚1 mL,IAA 2mL,酶液1mL,磷酸缓冲液5 mL,混合均匀.在4号试管中除酶液用磷酸缓冲液代替外,其余成分相同。一起置于30℃恒温水浴中,保温30min.
(4).从每个试管中吸取反应混合液2 mL,加入吲哚乙酸试剂B 4mL,摇匀,置于30℃黑暗处保温30 min,使显色。
(5).将显色后呈红色的反应液于分光光度计中测定吸光度,测定使用波长530 nm。
(6).标准曲线的制作
①配制吲哚乙酸溶液,浓度分别为0、0.5、1.0、2.5、5.0、15、20、25、35μg·mL-1
②取干净的大试管9支,每支加入吲哚乙酸试剂B 4mL,再分别加入不同浓度的吲哚乙酸溶液2mL,摇匀,并于40℃的黑暗处保温30min。
③测定反应液在530nm处的吸光值,以吲哚乙酸的浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线或进行回归,求得标准曲线的回归方程。
(7).根据读数从标准曲线上查出相应的吲哚乙酸残留量(或从回归方程计算反应液中IAA的残留量)。
(8).从开始时加入的吲哚乙酸量减去酶作用后残留的吲哚乙酸量,即得被酶所分解破坏的吲哚乙酸量。以每毫升酶液在1h内分解破坏吲哚乙酸量(μg)表示酶活力的大小。按下式计算样品中酶的活力,单位为μg IAA·g-1FW·h-1

iaa氧化酶活性计算公式

式中,U:样品中酶活力(μg IAA·g-1FW·h-1);
c1:反应液中残留的IAA含量(μg·mL-1);
Vs:反应液中酶液的体积(mL);
VT:样品制得的酶液总体积(mL);
t:反应时间(min);
FW:样品鲜重(g)。

4.注意事项

反应液中IAA的起始浓度为35μg/mL,A530已接近1,会带来较大的测量误差(吸光度值在0.2-0.6左右时测量的误差最小),因而可将反应液稀释后进行测定。

400-066-8286