1.原理

    乙醇酸氧化酶(Glycolic acid oxidase)是以黄素单核苷酸(FMN)为辅基的氧化酶,它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸。

    乙醇酸氧化酶是植物光呼吸中一个有代表性的酶。核酮糖-1,5-二磷酸:(RuBP)在RuBP Case的作用下,生成了一个三碳化合物和一个磷酸乙醇酸,后者脱磷后,就生成乙醇酸,即植物光呼吸的底物。乙醇酸在叶绿体中产生,在过氧化体内被乙醇酸氧化酶氧化为乙醛酸,最后在线粒体中放出一分子CO₂。

    本实验用菠菜叶片为材料提取乙醇酸氧化酶。乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧;化成乙醛酸,生成的乙醛酸与苯肼反应生成苯腙。苯腙在324nm处有强烈吸收,用紫外分光光度计测定样品在324 nm处吸光度的变化，叮计算出苯腙生成的量。进行的反应如下:

     由上述反应式可以看出,氯化一分子乙醇酸就有一分子苯腙形成。叮根据生成苯腙的量计算乙醇酸氧化酶的酶活力。

2.材料、仪器设备及试剂

(1)材料

     菠菜叶片、小麦叶片、玉米叶片。

(二)仪器设备

    紫外分光光度计,冷冻离心机，匀浆器,试管。

(三)试剂

    (1)50mmol/L盐酸苯肼溶液,用1mmol/LNaOH调至pH6.0。

    (2)100 mmol/L(pH7.5)磷酸缓冲液。

    (3)50 mmol/L CH₃COONa(乙醇酸钠)溶液。

    (4)提取介质:40 mmol/L( pH7.6)Tris - HCI缓冲溶液内含10 mmol/L MgCl₂、0.25 mmol/L EDTA、5 mmol/L谷胱甘肽。

3.实验步骤

(一)酶液的制备

    取新鲜菠菜叶片30g,加60mL预冷的提取介质,在匀浆器中高速匀浆2次,每次30s;匀浆经4层纱布过滤,滤液于2℃ 1000 x g离心10 min,弃沉淀;把固体硫酸铵粉末按100 mL溶液加入11g的比例放进上清液中,边加边搅动,使溶液达20%饱和度,待硫酸铵完全溶解后,于2℃ 2000 x g离心20min,弃沉淀;再以100mL溶液加6g的比例向上清液中加人硫酸铵,使溶液达30%的饱和度,再于2℃ 2000 x g离心20min.沉淀用100mmol/L(pH7.5)磷酸缓冲液溶解，置冰箱内备用。

(二)酶活性的测定

    在1cm光程的石英比色杯内加人0.3mL50mmol/L盐酸苯肼、2.5mL100 mmol/L(pH 7.5)磷酸缓冲液、0.1 mL酶提取液,摇匀后在紫外分光光度计上324nm处测定吸光度,作为反应的零时值。吸取0.1mL50mmol/L乙醇酸钠溶液加入比色杯,立即计时,每30s测定一次吸光度,共测3min。从第一分钟内吸光度的变化值计算酶活力。

4.结果计算

    按下式计算乙醇酸氧化酶的酶活力:

    式中:△A为反应开始后最初一分钟内324nm处吸光度的变化值;N为稀释倍数;17.0为苯腙在324 nm处的吸光系数;d为比色杯光程;△t为本实验反应时间,是1 min;酶活力单位为单位时间、单位酶液中所含乙醇酸的微摩尔数[umol/(mL•min) ]。

[附注]

    测定乙醇酸氧化酶活性还可用测压法和2,6-二氯酚吲哚酚还原法。

 

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