1、待测组分的提取

       对干像色素、植物激素、氨基酸、可溶性糖、有机酸等小分子物质的提取,首要的是选择适当性质的溶剂。一般而言,极性的(亲水的)待测组分易溶于极性溶剂中,非极性的(亲脂的)待测组分易溶于非极性的有机溶剂中。提取液的pH影响待测组分的解离状态及其活性和稳定性,不可忽视。例如叶绿素可以用95%乙醇或丙酮溶液提取,脱落酸.赤霉素可用丙酮.甲醇溶液提取.还原糖可用蒸馏水提取,维生素C可用2%草酸溶液提取。两性物质氨基酸在等电点以外的任何pH溶液中都是呈解离态,一般可用10%乙酸提取。为了使待测组分能更快、更充分地从其他细胞组分中分离出来,可以采用电炉加热,煮沸、恒温水浴保温、剧烈搅拌或振荡等,这样就可以使待测组分最大限度地存在于提取液中,再经过离心或过滤除去残渣,即可得到较理想的粗提液。

      对于像核酸.蛋白质及酶等生物大分子的提取,则要相对复杂一些。一般情况下,碱性生物大分子物质易溶于酸性溶剂,酸性生物大分子物质易溶于碱性溶剂。由于不同蛋白质分子中,含有不同比例的极性基团与非极性基团,氨基酸排列顺序有很大差别,因此,提取蛋白质时,要根据蛋白质的结构及溶解性质、等电点等因素配制不同的蛋白质提取液。一般而言,蛋白质提取液以水为主.再加少量酸、碱或盐组成。这样可以通过少量离子的作用,减少蛋白质分子极性基团之间的静电引力,加强蛋白质与提取液之间的相互作用,从而提高其溶解性。缓冲液的pH应选择在偏离等电点的两侧,使蛋白质分子带上净电荷,以提高其溶解度。对于某些与脂质结合得比较牢固的蛋白质复合体或含脂肪族氨基酸较多的蛋白质,疏水性强,则需要在微碱性提取液中加入一定浓度的表面活性剂,如十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS)或高浓度的有机溶剂(如70%~80%的乙醇)。

      在提取酶时,一定要在冰浴上或低温室内操作。其提取液应为偏离等电点两侧的pH缓冲液,离子强度适中,以维持酶结构的稳定。此外,还应加人适量的巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP),以防止酶分子中的巯基氧化和样品中的酚氧化。重金属离子的络合剂乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetracetie acid,EDTA)也是提取液中常用的成分之一,以防酶变性失活。为防止酶蛋白在分离过程中发生降解,还需加人蛋白酶抑制剂。

      对核酸的提取方法有多种。提取核酸时,常采用盐溶法,即根据DNA核蛋白易溶于高盐(1~2mol/L NaCl)溶液,难溶于低盐(0.14 mol/L NaCl)溶液,而RNA核蛋白则易溶于低盐(0.14mol/LNaCl)溶液这一原理进行提取的。对RNA和DNA的分离(separation)也叮根据RNA易被碱解,DNA易被酸解的性质进行。在提取植物组织中的DNA时,常用液氮冻融法改善匀浆效果,缩短匀浆时间,并具有抑制DNase活性的效果。匀浆缓冲液中加人溴化乙锭.可显著提高DNA的纯度(purity )和相对分子质量( molecuiar weight)。

2、待测组分的分离纯化

      在一般的生理生化分析中,如果待测组分与分析试剂(如显色剂、氧化还原剂)反应的专一性程度高,受其他杂质的+扰少,则不需要进一步纯化(purica-tion)。但在制备性生化实验中,必须采用一系列生化分离纯化技术,除去粗提取液中的杂质(异类物质和同类物质),以制成高纯品。常用的生化分离纯化技术有:盐析技术、离心技术、电泳技术、层析技术等,这里重点介绍盐析技术和透析技术,其他技术内容较多,将在本书中另列章节介绍。

2.1 盐析

      向含有待测组分的粗提取液中加入高浓度中性盐达到一定的饱和度,使待测组分沉淀析出的过程称为盐析(alingout)。蛋白质、酶、多糖、核酸等都可应用盐析技术进行沉淀分离。但该技术在蛋白质或酶的分离纯化中应用最广泛,它是一种由提取到分离纯化的衔接技术。其原理是,蛋白质或酶分子的稳定因素一靠电荷,二靠水膜;而当溶液中的中性盐浓度增至一定的程度时,蛋白质分子表面电荷被中和,包围蛋白质分子的水膜被破坏,导致蛋白质分子溶解度下降,而凝聚析出。

      在盐析中使用的中性盐种类很多,如硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、醋酸钠等。最常用的中性盐是硫酸铵,它的溶解度大,受温度影响小,不易引起蛋白质变性,价格便宜。在使用硫酸铵进行蛋白质盐析时,要选用纯度较高的或重结晶的硫酸铵。硫酸铵的浓度常用饱和度表示,达到饱和状态时的硫酸铵饱和度为100%。不同的硫酸铵饱和度可用加人固体盐法、加人饱和溶液法及透析平衡法任意调节。不同浓度的蛋白质溶液.使用硫酸铵的饱和度范围是有差别的。蛋白质浓度较高时,需硫酸铵量较少;蛋白质浓度较低时,需硫酸铵量较多。在具体进行盐析时,因制备阶段不同,其操作方法有差异。一般在制备早期,应保持一定的pH和温度,而改变离子强度(盐浓度)进行蛋白质的分步分离。在制备后期,分离纯化及结晶阶段,则往往保持一定的离子强度,而改变pH和温度。为保证实验的重现性好,对盐析的条件如pH、温度和硫酸铵的纯度、用量都必须严加控制。盐析后放置0.5h至1h,沉淀完仝后,可采用离心法或过滤法进行固液分离。

2.2 透析

      透析(dialysis)是膜分离技术的一种,用于分离大小不同的分子。透析膜只允许小分子通过,而阻止大分子通过。盐析得到的蛋白质沉淀,用缓冲液悬浮,装入透析袋内进行脱盐,可以除去硫酸铵等盐类。具体方法是,把盛有蛋白质溶液的透析袋两端系紧,悬挂在装有缓冲液的三角瓶中,置于磁力搅拌器上,在低温(4℃左右)条件下透析30~36h,由子透析袋只允许小分子盐类透过,而蛋白质大分子不能逸出膜外.经多次更换透析外液,不断降低膜外液中小分子盐类的浓度,即可将混杂于蛋白质大分子中的盐类等杂质透析掉。在透析时,要选用透析速度快、透性界限明确的透析袋。

3、浓缩与干燥

3.1 浓缩

      通过对水或溶剂的吸收和透析等方法,使低浓度溶液变为高浓度溶液的过程称为浓缩。

       浓缩的方法很多.如加热蒸发、加沉淀剂、离子交换法、吸收法、减压浓缩法、膜浓缩法、亲和层析法等。在实验室中最常用的是吸收浓缩法,即通过向溶液中投人吸收剂(如聚乙二醇、聚丙烯酰胺干凝胶等),直接吸收溶液中的水分,使溶液浓缩的方法。在使用吸收剂时,也可先将生物大分子溶液装人透析袋里,扎紧袋口,外加聚乙二醇覆盖,袋内水分渗出,即被聚乙二醇迅速吸收而被浓縮,可称为高渗透析法,兼有脱盐效果。其次是超滤法,是指使用一种特制的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法。应用超滤法,关键在子滤膜的类型、规格的选择。该法除浓缩、脱盐外,还可应用于生物大分子的分离纯化中,如进行多成分提取液的分离时,可先用超滤器分组,再进行柱层析,可将多种待测组分分离。

      此外,还常用减压浓缩法对不耐热的生物大分子及生物制品进行浓缩。其原理是通过降低液面之上的气体压力使液体沸点降低,加快蒸发。

3.2 干燥

      所谓干燥就是将潮湿的固体及液体中的水或溶剂清除干净的过程。在牛化研究中最常用的干燥方法是真空干燥法(减压干燥法)和冰冻真空干燥法(升华干燥法)。前者适用于不耐高温、易氧化物质的十燥和保存,其真空度越高,溶液沸点越低,蒸发越快;后者适用于蛋白质、酶等各类生物大分f的十燥保存,可保持其天然结构与活力。在相同压力下,水蒸气压力随温度的下降而下降,因而在.低温和高度真空下,水分安成固态冰,冰可以升华为气体,并直接被真空泵抽走而得以干燥。

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