叶绿体色素的提取和分离

一、原理:

      叶绿体中含有绿色素(包括叶绿素a和叶绿素b)和黄色素(包括胡萝卜素和叶黄素)两大类。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水,而溶于有机溶剂,故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同.当用适当的溶剂推动时,混合物中各种成分在两相(固定相和流动相)间具有不同的分配系数,所以移动速度不同,经过一定时间后,可将各种色素分开。

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料

      菠菜、小白菜叶片。

(二)仪器设备

      研钵,漏斗,三角瓶,剪刀,滴管,培养皿(直径11 cm),康维皿或平底短玻管,圆形滤纸(直径11cm)。

(三)试剂

      (1)95%乙醇。(2)石英砂。(3)碳酸钙粉。(4)推动剂:按石油醚:丙酮:苯(10:2:1)比例配制( V/V)。

三、实验步骤

1.叶绿体色索的提取

       (1)取菠菜或其他植物新鲜叶片4~5片(2 g左右),洗净,擦下.去掉中脉剪碎,放入研钵中。

       (2)研钵中加人少量石英砂及碳酸钙粉,加2~3 ml, 95%乙醇,研磨至糊状,再加10~15mnL95%乙醇,离心35min,提取上清液过滤于.角瓶中,残渣用10 mL 95%乙醇冲洗,一同过滤于三角瓶中。

       (3)如无新鲜叶片,也可用事先制好的叶干粉提取。取新鲜叶片(以菠菜叶最好),先用105℃杀青,再在80℃下烘干,研成粉末,密闭贮存。用时称叶粉2g ,放人小烧杯中,加95%乙醇20~30mL浸提,并随时搅动。待乙醇呈深绿色时,滤出浸提液备用。

2.叶绿体色素的分离

       (1)取圆形定性滤纸一张(直径11 cm),在其中心戳- -圆形小孔(直径约3 mm) ,另取一张滤纸条(5 cmx 1.5 cm),用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液,沿纸条的长度方向涂在纸条的一边,使色素扩散的宽度限制在0.5 cm以内,风干后,再重复操作数次,然后沿长度方向卷成纸埝,使浸过叶绿体色索溶液的一侧恰在纸捻的一端。

       (2)将纸捻带有色素的一端插人圆形滤纸的小孔中,使与滤纸刚刚平齐(勿突出)。

       (3)在培养皿内放-康维皿,在康维皿中央小室中加人适量的推功剂,把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上,使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿(图1)。此时,推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上,并把叶绿体色素向四周推动,不久即可看到各种色素的同心圆环。

叶绿体色素的提取和分离

图1分离叶绿体色素的圆形纸层析装置(纵断面)

      如无康维皿,也可在培养加中放人一平底短玻管或塑料药瓶盖,以盛装推动剂。所用培养皿底、盖的直径应相同,且应略小十滤纸直径,以便将滤纸架在培养皿边缘上。

      (4)当推动剂前沿接近滤纸边缘时,取出滤纸,风干,即可看到分离的各种色系:叶绿素a为蓝绿色,叶绿素b为黄绿色,叶黄素为鲜黄色,胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色索的位置和名称。


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