酶活性检测的方法有很多,总的概括起来,分为仪器分析法和自动分析法,前面我们介绍的电化学法测定酶活就是仪器分析法,下面我们还将要介绍两种仪器分析法,即分光光度法与荧光分光光度法。

分光光度法仪器

1.分光光度法

    若一底物或产物能选择性吸收某一特定波长的光,则可根据该物质在特定波长下的吸光度值的变化来判断酶的活性。吸光度A可由下式求出:

A=lg(I/I0

    式中I0一入射光的强度,I—透过待测溶液的光的强度,根据Lambert-Beer定律,吸光度与待测溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比:

A=εCL

    式中ε一摩尔吸光系数,C—摩尔浓度,L-液层厚度(cm)。上述关系对于可见光区(400—700nm)或紫外光区(200—400nm)的单色光和稀溶液均适用.

    在用分光光度法进行酶活性的测定时,盛有反应混合物的比色槽温度必须控制在±0.2℃的变化范围内,因为温度每变化1℃,反应速度将改变约10%,恒温控制是通过一个与循环的恒温水浴相连的、带夹套的比色槽架来实现的.

    分光光度法特别适用于测定涉及辅酶NAD+或NADP+ 的反应或与这类反应偶联的反应.但是,这种方法有两个主要的缺点:
(1)它只适用于测定吸光度值在0.05—1.0之间的稀溶液.当吸光度值较高吋,除测量准确度减低外,由于浓溶液中溶质分子间的相互作用,还会引起对Lambert-Beer定律的偏离,造成误差.
(2)当光吸收的背景值较高 或当样品溶液中存在悬浮颗粒(如血液细胞或微生物)散射了一部分入射光时,也会产生误差,为此,在测定前,需将粗样本进行纯化处理(如透析、选择沉淀和离心)。

2.荧光分光光度法

    能吸收某一波长的光并发射出一较长波长的光的化合物称为荧光物质.对于某一荧光物质的稀溶液而言,发出的荧光的强度(If)与适当波长的入射光的强度(I0)成正比:

If=φ2·3I0εCL

    式中,φ为荧光物质的荧光效率(发出的荧光量子数与所吸收的激发光的量子数的比值),ε为摩尔吸光系数,C为荧光物质的摩尔浓度,L为液层厚度.

    一般地说,荧光分光光度法比分光光度法灵敏度高些(从理论上讲,约高102倍).因此,在许多情况下,它已取代 了较经典的分光光度法.但是,荧光效率随温度而变化,故在整个测定过程中保持温度恒定十分重要.

    NAD+和NADP+具有强烈的荧光,在340nm的激发波长下,能发射出460nm的荧光.因此,任何有它们作为辅酶的酶催化反应均可用灵敏的荧光分光光度法予以测定.这种方法也广泛用于酶催化水解反应的研究.因为,一些酶能催化无荧光的酯水解成有强荧光的醇或胺.例如,有人提出了根据下列反应

酶活性测定公式

    测定三酰甘油脂酶的活性.同样,荧光素二醋酸酯可作为脂酶的底物;而强荧光的4-甲基伞形酮的衍生物常用于测定酯酶、糖苷酶、磷酸酶和硫酸酯酶的活性

    荧光分光光度法的主要问题是荧光的猝灭,即由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的现象。此外,酪氨酸和色氨酸能在330-350nm处发荧光。由于它们的残基常存在于酶分子中,故会在紫外光区造成较大的发射背景值。因此,应尽可能在可见光区进行荧光分析。

400-066-8286