氨基酸(aminoacid)是组成蛋白质的基本单位,也是蛋白质的分解产物。植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输。所以,测定植物组织中不同时期、不同部位游离氨基酸的含量对于研究根系生理、氮素代谢有一定意义。本文介绍了植物组织中游离氨基酸总量的测定(茚三酮溶液显色法)的测定方法,包括氨基酸总量测定的原理,实验所需试剂,实验步骤以及实验注意事项。

氨基酸总量测定

原理:

      氨基酸与茚三酮共热时,能定量地生成二酮茚胺。该产物显示蓝紫色,称为Ruhemans紫。其吸收峰在570nm,而且在一定范围内吸光度与氨基酸浓度成正比。氨基酸与茚三酮的反应分两步进行,第一步:氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步:所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和氨缩合生成Ruhemans紫。

材料、仪器设备及试剂

(一)材料

      各种植物组织。

(二)仪器设备

      722型分光光度计,分析天平,研钵,容量瓶,试管,移液管,水浴锅,三角瓶,漏斗。

(三)试剂

      (1)水合茚三酮试剂:称取0.6 g再结晶的茚三酮置烧杯中,加人15 mL正丙醇,搅拌使其溶解。再加人30 mL正丁醇及60 mL乙二醇,最后加入9 mL pH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液,混匀,贮于棕色瓶,置4C下保存备用,10d内有效。

      (2)乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.4 ):称取乙酸钠54.4 g加入100 mL无氨蒸馏水,在电炉比加热至沸,使体积蒸发至60 mL左右。冷却后转入100 mL容量瓶中加30mL冰醋酸,再用无氨蒸馏水稀释至100mL。

      (3)标准氨基酸;称取80C下烘干的亮氨酸46.8 mg,溶于少量10%异丙醇中,用10%异丙醇定容至100 mL。取此液5 mL,用蒸馏水稀释至50 mL,即为含5ug/mI.氨基氮之标准液。

      (4)0.1%抗坏血酸:称取50 mg抗坏血酸,溶于50 mL无氨蒸馏水中,随配;随用。

      (5)10%乙酸。

实验步骤步骤

(一)样品制备

      取新鲜植物样品,洗净、擦干并剪碎、混匀后,迅速称取0.5-1.0g,于研钵中加入5mL 10%乙酸,研磨匀浆后,用蒸馏水稀释至100mL。混匀,并用干滤纸过滤到三角瓶中备用。

(二)制作标准曲线

      取6支20mL刻度试管,按表1操作。

表1 制作游离氨基酸标准曲线各试剂量及操作程序
试剂 管号
1 2 3 4 5 6
标准氨基酸/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
无氨蒸馏水/mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
水和茚三酮/mL 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
抗坏血酸/mL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
每管含氨量/ug 0 1 2 3 4 5

      加完试剂后混匀,盖上大小合适的玻璃球,置沸水中加热15 min, 取出后用冷水迅速冷却并不时摇动,使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去,进而呈现蓝紫色时,用60%乙醇定容至20 mL。混匀后用lem 光径比色皿在570 nm波长下测定吸光度,绘制标准曲线。

(三)样品测定

      吸取样品滤液1.0mL,放人20mL干燥试管中,加无氨蒸馏水1.0mL,其他步骤与制作标准曲线相同。根据样品吸光度在标准曲线上查得含氮量。

结果计算

      按下式计算样品中氨基态氮的含量。

氨基酸总含量测定公式

      式中:C为标准曲线上查得的氨基态氮含量,ug;VT为样品稀释总体积,mL; Vs为测定时样品体积,mL;W为样品鲜重,gc

注:

      (1)茚三酮重结晶的方法:合格的茚三酮应该是微黄色结晶,若保管不当,颜色加深或变成微红色,必须重结晶后方可使用。其方法如下:5g茚三酮溶于15mL热蒸馏水中,加人0.25g活性炭,轻轻摇动,溶液太稠时,可适量加水,30min后用滤纸过滤,滤液置冰箱中过夜后即可见微黄色结晶析出,用千滤纸过滤,再用1 mL燕馏水洗结晶一次,置于干燥器中干燥后贮于棕色瓶中。

      (2)茚三酮与氨基酸反应所生成的Ruhemans紫在1h内保持稳定,故稀释后尽快比色。

      (3)空气中的氧干扰显色反应的第--步。以抗坏血酸为还原剂,可提高反应的灵敏度,并使颜色稳定。但由于抗坏血酸也可与茚三酮反应,使溶液颜色过深,故应严格掌握加人抗坏血酸的量。

      (4)反应温度影响显色稳定性,超过80心,溶液易褪色;可在80C水浴中加热,并适当延长反应时间,效果良好。

      (5)谷物籽粒等含蛋白质的样品可用酸水解法将蛋白质水解后,用本法测定水解液中的氨基酸含量,可计算出样品蛋白质含量。

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