色谱分析技术以其分离速度快、分离效率高、灵敏度高等众多优点,被广泛应用于植物/水质/土壤检测等领域。不管是色谱柱的使用还是检测数据的色谱分析都会遇到很多问题,本文将会整理这方面的问题并加以分析解决。

色谱柱结构示意图

1.刚买来的色谱柱需要注意什么?

新买的色谱柱需要进行活化,新的色谱柱在使用之前,必须用100%甲醇 30-40 倍柱体积进行冲洗活化。

2.如何过渡到流动相?

先用流动相使用的有机溶剂冲洗 20-30 倍柱体积,将流动相中的缓冲盐换成水,冲洗 20-30 倍柱体积,继续用流动相冲洗 30-40倍柱体积。

3.色谱柱使用后怎么进行冲洗保存?

使用完色谱柱,先用乙腈:水=10:90 冲洗 60 倍柱体积,再用100%乙腈冲洗 40 倍柱体积,保存于乙腈中,最后注意拧紧色谱柱两头的堵头,放置好。如果长时间不用色谱柱,要定期用乙腈冲洗色谱柱,保证色谱柱中的保存液不干涸。

4.基线不平?

(1)可能是平衡时间过短:延长平衡时间。
(2)色谱柱被污染了:冲洗色谱柱。
(3)色谱柱没有连接好,有漏液现象:检查连接情况。
(4)液相仪器检测器污染:进行仪器维护。
(5)液相仪器检测器氘灯能量过低:更换检测器氘灯。

鬼峰

5.遇到鬼峰怎么办?

(1)进样阀残余峰:用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗。
(2)样品中未知物:处理样品。
(3)柱未平衡:重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)。
(4)三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱):每天新配,用抗氧化剂。
(5)水污染(反相):通过变化平衡时间检查水质量,用HPLC级的水。

6.主峰与杂质峰分不开?

(1)调整流动相比例,加大缓冲液的比例。C18 柱调整流动相至离子对试剂:乙腈=92:8,C8 柱调整流动相至离子对试剂:乙腈=90:10(液相方法)。
(2)将柱温设置于 40℃以上。

7.色谱柱蛋白污染,如何再生?

冲洗色谱柱的步骤如下:(前步无法将色谱柱再生,进行下一步)1%乙酸水溶液 →1%三氟乙酸水溶液 → 0.1%三氟乙酸:异丙醇=40:60 → NaCl,Na3PO4,Na2SO4 水溶液 0.5-1.0M (Na3PO4 pH7.0) →DMSO:水=50:50/DMF:水=50:50。

8.主峰出现裂分,峰型较宽怎么办?

(1)样品体积过大:用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%。
(2)色谱柱污染:冲洗色谱柱,若严重污染,更换色谱柱。
(3)色谱柱填料塌陷:维修或更换色谱柱。
(4)液相仪器柱外效应过大:更换管路,减小柱外效应。
(5)溶剂效应:用国标方法溶解,降低溶解溶剂强度。
(6)将色谱柱柱温过低:提高柱温。

9.压力不稳是什么原因,如何解决?

(1)泵内有空气:清除泵内空气,对溶剂进行脱气处理。
(2)泵密封垫损坏:更换密封垫。
(3)比例阀失效:更换比例阀。
(4)溶剂中有气泡:对溶剂脱气,必要时改变脱气方法。
(5)系统漏液:找出漏点,密封。
(6)梯度洗脱:压力波动是正常的。
(7)单向阀堵塞:超声波清洗单向组件。
(8)单向阀泄露:更换密封装置。

10.保留时间延长?

(1)流速下降:管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡。
(2)硅胶柱活性变化:可以用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用其它碱钝化色谱柱柱。
(3)键合相流失:流动相 pH 值超出适用范围,色谱柱连接方向错误。
(4)流动相组成变化:防止流动相蒸发或沉淀。
(5)温度降低。

11.保留时间缩短?

(1)流速增加:检查泵,重新设定流速。
(2)样品超载:降低样品进样量。
(3)键合相流失,流动相 pH 值超出适用范围,色谱柱连接方向错误。
(4)流动相组成变化:防止流动相蒸发或沉淀。
(5)温度增加。

峰拖尾

12.峰拖尾怎么处理?

(1)柱超载:降低样品量,增加柱直径或采用较高容量的固定相。
(2)峰干扰:清洁样品,调整流动相。
(3)硅羟基作用:加三乙胺,用碱屏蔽硅羟基活性,增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值,钝化样品。
(4)筛板堵塞:超声清洗或更换筛板,加在线过滤器过滤样品。
(5)柱塌陷或形成短路通道:更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件。
(6)死体积或柱外体积过大:尽可能采用细内径的连接管。
(7)柱效下降:用较低腐蚀条件,更换柱或采用保护柱。

峰展宽

13.峰展宽怎么处理?

(1)进样体积过大:用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%。
(2)在进样阀中造成峰扩展:进样前后排除气泡以降低扩散。
(3)数据系统采样速率太慢:设定速率应是每峰大于10点。
(4)检测器时间常数过大:设定时间常数为第一峰半宽的10%。
(5)检测池体积过大:用小体积池,卸下热交换器。
(6)流动相粘度过高:增加柱温,采用低粘度流动相。
(7)保留时间过长:将连接管径和连接管长度降至最小,采用细内径管路。
(8)柱外体积过大:将连接管径和连接管长度降至最小,采用细内径管路。
(9)样品过载:降低进样浓度,或减少进样体积。

    总之,色谱柱使用与色谱分析中常见的问题还是很多,遇到问题要掌握色谱常见故障排除原则,即(1)确定问题在哪;(2)一次只改变一种因素,方便对照;(3)确保同样的问题发生过两次;(4)认真记录好排除故障的工作。

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