本文介绍了植物中叶绿体色素的理化性质的实验方法。本实验详细介绍了叶绿体色素的理化性质测定的基本原理，试剂，仪器和实验步骤。
一、原理：
叶绿素是一种二羧酸一叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯,故可与碱起皂化反应而生成醇(甲醇和叶绿醇)和叶绿酸的盐,产生的盐能溶于水中,可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性,表现出一定的吸收光谱,可用分光镜检查或用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子,因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定,容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后,破坏更快,而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H'所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素,锕代叶绿素很稳定,在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
皂化反应式如下:
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
菠菜叶片。
(二)仪器设备
刻度试管,小试管,试管架,分光镜,石棉网,烧杯,酒精灯,玻棒,铁三角架,刻度吸量管,火柴。
(三)试剂
(1) 95%乙醇。(2)苯。(3)醋酸铜粉末。(4)5%的稀盐酸。
(5)醋酸一醋酸铜溶液:用50%的醋酸100mL溶人醋酸俐6g,再加蒸馏水4倍稀释而成。
(6)KOH-甲醇溶液:20gKOH溶人100mL甲醇中,过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂中。
三、实验步骤
本实验第一项中提取的叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆,进行以下实验:
1.光对叶绿素的破坏作用
(1)取4支小试管,其中两支各加人5mL用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5 mL叶绿体色素乙醇提取液,并用95%乙醇稀释1倍。
(2)取1支装有叶绿体色素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片匀浆的试管,放在直射光下，另外两支放到暗处,40 min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。
(3)另取本实验中用圆形滤纸层析分离成的色谱一张,通过圆心裁成两半，一半放在直射日光下,另一半放在暗中,半小时后比较两张色谱上的四种色素的颜色各有何变化。
2.荧光现象的观察。
取1支20mL刻度试管加人5mL浓的叶绿体色素乙醇提取液,在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同?解释原因。
3.皂化作用(绿色素与黄色素的分离)
(1)在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加人1.5 mL20%K0H-甲醇溶液,充分摇匀。
(2)片刻后，加入5 mL苯,摇勾.再沿试管壁慢慢加入1~1.5 mL蒸馏水,轻轻混匀(勿激烈摇荡),于试管架上静置分层。若溶液不分层,则用滴管吸取蒸馏水,沿管壁漓加,边滴加边摇动,直到溶液开始分层时,静置。可以看到溶液逐渐分为两层,下层是稀的乙醇溶液,其巾溶有皂化的叶绿素a和b(以及少量的叶黄素).上层是苯溶液,其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。
4.吸收光谱的观察
将上述已分层的试管溶液,用分光镜观察两类色素的吸收光谱,首先让下层绿色素部分对准进光孔,看光谱有何变化，然后再将上.层黄色素溶液对准进光;孔,看光谱又有何变化。把观察的结果用简单的图表示出来。
5.H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用
(1)取两支试管。第一支试管加叶绿体色素提取液2 mL,作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液5mL,再加入5%HCI数滴,摇匀,观察溶液颜色变化。
(2)当溶液变褐后,再加入少量醋酸铜粉末.微微加热,观察记载溶液颜色变化情况,并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。
(3)另取醋酸-醋酸铜溶液20mL,置于烧杯中。取新鲜植物叶两片，放入烧杯中,用酒精灯慢慢加热,随时观察并记录叶片颜色的变化,直至颜色不再变;化为止。解释原因。
注意事项
(1)在低温下发生皂化反应的叶绿素体色素溶液,易乳化而出现白色絮状物,溶液浑浊,且不分层。可激烈摇匀,放在30-40℃水浴中加热,溶液很快分层,絮状物消失,溶液变得清澈透明。
(2)分离色素用的圆形滤纸,在中心打的小圆孔,周闱必须整齐,否则分离:的色素不是一个同心圆。
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