进入生物体内的一些分子氧(O2),可经单电子还原转变为超氧阴离子自由基(O2-),特别是在逆境条件下这种单电子还原的几率更大。O2-既可直接作用于蛋白质(酶)和核酸等生物大分子,也可衍生为羟自由基(-OH)、单线态氧(1O2)、过氧化氢(H2O2)及脂质过氧物自由基(RO-、ROO-)等活性氧,引起对细胞结构和功能的破坏。因此测定逆境条件下植物组织中O2-产生及清除速率,可间接了解组织细胞受损状况和抗性强弱。本文将会介绍超氧阴离子自由基含量测定原理、方法步骤以及实验注意事项。

植物抗逆研究

1.原理

    O2-能与羟胺溶液反应生成NO2-:

NH2OH+2O2- +H+ =NO2- + H2O2 +H2O

NO2-经对氨基苯磺酸和α-萘胺显色反应生成对苯磺酸-偶氮-α-萘胺(红色),其显色反应如下:

HOO2S-C6H4-NH3·CH3COOH+HNO2--HOO2S-C6H4-N2(CH3COO)+H2O
对氨基苯磺酸                亚硝酸

HOO2S-C6H4-N2(CH3COO)+C10H7NH2--HOO2S-C6H4-N2C10H6·NH2+CH3COOH
α-萘胺                              红色偶氮物质

    该红色产物在530nm有专一吸收峰。根据NO2-显色反应的标准曲线将A530换算成NO2-浓度,再根据反应式直接进行O2-化学计量,即NO2-浓度乘以2得O2-浓度。

    苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸的脱氨反应,生成反式肉桂酸。根据反式肉桂酸在290nm处吸光度的变化可以测定该酶的活性。

2.仪器设备

(1)分光光度计 (2)高速冷冻离心机
(3)研钵 (4)移液管:0.5mL 1支,1 mL 2支,2 mL 4支
(5)试管:5 mL 1支,20 mL 13支 (6)恒温水浴

3.试剂

(1).65mmol·L-1磷酸缓冲液,pH7.8。
(2).17mmol·L-1对氨基苯磺酸:称取2.94g对氨基苯磺酸,加25mL浓HCl溶解,蒸馏水定容至1000mL。
(3).7mmol·L-1 α-萘胺:称取α-萘胺1.0g,加25mL冰醋酸溶解,蒸馏水定容至1000mL。
(4).10 mmol·L-1 HCl羟胺。
(5).NaNO2标准液:称取NaNO2(AR级)0.1000g,蒸馏水定容至100mL,摇匀后取5mL用蒸馏水定容至1000mL,即为每毫升含NO2- 5μg的标准液。

4.材料

    正常生长的或经逆境处理的叶片等植物新鲜组织。

5.方法步骤

(1)标准曲线的制作:取20mL试管7支,编号,按下表顺序添加试剂,每加一种试剂摇动试管使之混匀:

试剂 试管号
1 2 3 4 5 6 7
NaNO2标准液/mL 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
蒸馏水/mL 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0
对氨基苯磺酸/mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
α-萘胺试剂/mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
每管NO2-含量/μg 0 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10

    加完试剂后将试管置30℃水浴保温30min,显色反应后测定A530,以NO2-浓度为横坐标,A530值为纵坐标,绘制标准曲线

(2)O2-的提取:取待测植物样品2-4g于研钵中,加适量65mmol·L-1磷酸缓冲液(pH7.8)研磨匀浆, 定容10mL,四层纱布过滤,滤液经10000r/min离心10min,取上清液备用。
(3)O2-的测定:取试管3支,各加样品提取液(上清液)2mL,磷酸缓冲液1.5mL,盐酸羟胺0.5mL,混合后25℃恒温水浴保温20min。另取3支试管,从上述3支试管中各取反应液2.0mL,对应加入到3支试管中,各加17 mmol·L-1对氨基苯磺酸2.0mL,7mmol·L-1 α-萘胺2.0mL,30℃恒温水浴中反应30min,反应后测定显色液A530(标准曲线1号试管液调零),记录测定数据。

(4)O2-含量计算:从标准曲线上查出样品测定液对应NO2-的浓度,并换算成O2-的浓度(X),按下式计算O2-含量

计算公式

    式中,Vt:样品提取液的体积(mL);2:测定时样品提取液的稀释倍数;FW:样品鲜重(g);Vs:显色反应时取样品液的量(mL)。

6.注意事项

(1)、如果样品含有大量叶绿素将干扰测定,可在样品与羟胺反应后用等体积乙醚萃取叶绿素,然后再进行显色反应。
(2)、介质尽量减少Fe和O2的存在,α-萘胺不能用β-萘胺代替。
(3)、显色反应后也可用等体积的正丁醇萃取(混匀、静置分层或离心)红色偶氮物质,然后测定正丁醇相的A530

400-066-8286