进入生物体内的一些分子氧（O₂），可经单电子还原转变为超氧阴离子自由基（O₂-），特别是在逆境条件下这种单电子还原的几率更大。O₂-既可直接作用于蛋白质（酶）和核酸等生物大分子，也可衍生为羟自由基（^-OH）、单线态氧（¹O₂）、过氧化氢（H₂O₂）及脂质过氧物自由基（RO^-、ROO^-）等活性氧，引起对细胞结构和功能的破坏。因此测定逆境条件下植物组织中O₂-产生及清除速率，可间接了解组织细胞受损状况和抗性强弱。本文将会介绍超氧阴离子自由基含量测定原理、方法步骤以及实验注意事项。

1.原理

    O₂-能与羟胺溶液反应生成NO₂-：

NH₂OH+2O₂- +H+ =NO₂- + H₂O₂ +H₂O

NO₂-经对氨基苯磺酸和α-萘胺显色反应生成对苯磺酸-偶氮-α-萘胺（红色），其显色反应如下：

HOO₂S-C₆H₄-NH₃·CH₃COOH+HNO₂--HOO₂S-C₆H₄-N₂(CH₃COO)+H₂O
对氨基苯磺酸                亚硝酸

HOO₂S-C₆H₄-N₂(CH₃COO)+C₁₀H₇NH₂--HOO₂S-C₆H₄-N₂C₁₀H₆·NH₂+CH₃COOH
α-萘胺                              红色偶氮物质

    该红色产物在530nm有专一吸收峰。根据NO₂-显色反应的标准曲线将A₅₃₀换算成NO₂-浓度，再根据反应式直接进行O₂-化学计量，即NO₂-浓度乘以2得O₂-浓度。

    苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸的脱氨反应，生成反式肉桂酸。根据反式肉桂酸在290nm处吸光度的变化可以测定该酶的活性。

2.仪器设备

（1）分光光度计 （2）高速冷冻离心机
（3）研钵 （4）移液管：0.5mL 1支，1 mL 2支，2 mL 4支
（5）试管:5 mL 1支，20 mL 13支 （6）恒温水浴

3.试剂

（1）.65mmol·L^-1磷酸缓冲液，pH7.8。
（2）.17mmol·L^-1对氨基苯磺酸：称取2.94g对氨基苯磺酸，加25mL浓HCl溶解，蒸馏水定容至1000mL。
（3）.7mmol·L^-1 α-萘胺：称取α-萘胺1.0g，加25mL冰醋酸溶解，蒸馏水定容至1000mL。
（4）.10 mmol·L^-1 HCl羟胺。
（5）.NaNO₂标准液：称取NaNO₂（AR级）0.1000g，蒸馏水定容至100mL，摇匀后取5mL用蒸馏水定容至1000mL，即为每毫升含NO₂- 5μg的标准液。

4.材料

    正常生长的或经逆境处理的叶片等植物新鲜组织。

5.方法步骤

（1）标准曲线的制作：取20mL试管7支，编号，按下表顺序添加试剂，每加一种试剂摇动试管使之混匀：

试剂	试管号
	1	2	3	4	5	6	7
NaNO2标准液/mL	0	0.2	0.4	0.8	1.2	1.6	2.0
蒸馏水/mL	2.0	1.8	1.6	1.2	0.8	0.4	0
对氨基苯磺酸/mL		2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
α-萘胺试剂/mL	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
每管NO2-含量/μg	0	1.0	2.0	4.0	6.0	8.0	10

    加完试剂后将试管置30℃水浴保温30min，显色反应后测定A₅₃₀，以NO₂-浓度为横坐标，A₅₃₀值为纵坐标，绘制标准曲线

（2）O₂-的提取：取待测植物样品2-4g于研钵中，加适量65mmol·L^-1磷酸缓冲液（pH7.8）研磨匀浆， 定容10mL，四层纱布过滤，滤液经10000r/min离心10min，取上清液备用。
（3）O₂-的测定：取试管3支，各加样品提取液（上清液）2mL，磷酸缓冲液1.5mL，盐酸羟胺0.5mL，混合后25℃恒温水浴保温20min。另取3支试管，从上述3支试管中各取反应液2.0mL，对应加入到3支试管中，各加17 mmol·L^-1对氨基苯磺酸2.0mL，7mmol·L^-1 α-萘胺2.0mL，30℃恒温水浴中反应30min，反应后测定显色液A₅₃₀（标准曲线1号试管液调零），记录测定数据。

（4）O₂-含量计算：从标准曲线上查出样品测定液对应NO₂-的浓度，并换算成O₂-的浓度（X），按下式计算O₂-含量

    式中，Vt：样品提取液的体积（mL）；2：测定时样品提取液的稀释倍数；FW：样品鲜重（g）；Vs：显色反应时取样品液的量（mL）。

6.注意事项

（1）、如果样品含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品与羟胺反应后用等体积乙醚萃取叶绿素，然后再进行显色反应。
（2）、介质尽量减少Fe和O₂的存在，α-萘胺不能用β-萘胺代替。
（3）、显色反应后也可用等体积的正丁醇萃取（混匀、静置分层或离心）红色偶氮物质，然后测定正丁醇相的A₅₃₀。