细胞色素是电子传递体,其中细胞色素a和a3不易分离统称为细胞色素aa3,因其在传电子过程中能直接激活氧,使氧激发后成氧离子并与氢离子结合生成H2O和能量,故又称细胞色素氧化酶。细胞色素氧化酶存在于细胞线粒体的内膜上,它的活性往往作为细胞内氧化代谢的指标,也是线粒体的标志酶之一。通过本实验,学习测定细胞色素氧化酶的方法。

    本文介绍了磷钼蓝比色法定量测定植物伤流液无机磷含量的原理、实验器具、实验流程以及实验注意事项。

一、原理:

     已知细胞色素c(cytochrome c,cytc)的特征吸收峰是550 nm,其吸收系数是21.0,可以用单位时间内底物(cytc)的减少量来表示细胞色素氧化酶的活性。在反应的0时,测得底物的最大吸光度为Ao,然后经酶促反应t(min)后,再测定底物的吸光度为At,两者的差值除以吸光系数,就可以表示酶促反应的速率,即酶活性。

二、仪器设备

1. 分光光度计。
2. 天平。
3.冷冻离心机。
4.恒温水浴箱。

三、试剂

     1.酶液提取介质:1 μL•mL-1巯基乙醇、5 mmol•mL-1 EDTA、0.1 mol•L-1 Tris-柠檬酸缓冲液,pH 8.0。
     2.测定介质:50 mmol•L-1磷酸缓冲液、pH 7.1,0.2 mol•mL-1蔗糖、20 mol•mL-1还原型细胞色素c。

五、方法步骤

     1.酶液提取:称取欲测定组织1g,加入少量酶液提取介质,冰冻研磨1-2 min,用少量提取介质将匀浆转移干净,最后用提取液定容10mL,200目尼龙布过滤,滤液在5 000r•min-1,4°C下离心10min,得到的上清液即为粗酶液。

    2.酶活性测定步骤:测定温度25°C。在光径为1cm的玻璃比色杯中,加入3.0mL测定介:质,用分光光度计测定550nm处吸光度。以不含cytc的测定介质和酶液混合液调零,用加入25 μL煮死酶液(含蛋白约15 μg)测定管测定Ao,用加入25 μL酶粗提液测定550 nm处的光吸收值的下降值。每30 s间隔读数。连续记录5 min。每样品测定三个重复。

六、结果计算

    酶活性以每min每g鲜重或每mg酶蛋白氧化1μmol还原型cytc作为酶活力单位。

氧化酶活性测定

    式中,A。:杀死酵液的測定管的吸光度値;At:測定t(min)吋的吸光度値;ε:細胞色素的吸收系数(21.0);Vt:定容体釈;Vs:测定用酶液体积;FW:样品重(g);t:测定吋间(min)。

 

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