过氧化氢酶(catalase,CAT)普遍存在于植物组织中,是重要的保护酶之一,其作用是清除代谢中产生的H2O2,以避免H2O2积累对细胞的氧化破坏作用,因而其活性的高低与植物的抗逆性有关。本文将会介绍两种测定过氧化氢酶活性测定的方法,即紫外吸收法和碘量滴定法的原理、实验步骤和注意事项。

过氧化氢酶

1.紫外吸收法

1.1.原理

    H2O2对240nm波长的紫外光具有强吸收作用,CAT能催化H2O2分解成H2O和O2,因此在反应体系中加入CAT时会使反应液的吸光度(A240)随反应时间降低,根据A240的变化速率可计算出CAT的活性。

1.2.试剂

(1)50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH7.0).
(2)200 mmol·L-1 H2O和O2溶液:30%H2O和O2 11.36ml溶于磷酸缓冲液中,定量至250mL.
(3)50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH7.0).

1.3.方法步骤

(1)酶液的提取:称剪碎混匀的植物样品(如叶片等)1.00g置于预冷的研钵中,加适量磷酸缓冲液及少量石英砂,在冰浴上研磨匀浆,转移至10 ml量瓶中,用磷酸缓冲液冲洗研钵2-3次(每次1-2ml),合并冲洗液于量瓶中,定容至10ml,摇匀。取提取液5ml于离心管中,在4℃、15000g下离心15min,上清液即为酶提取液,4℃下保存备用。

(2)CAT酶活性测定:
①取10ml 具塞试管,加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死,冷却备用。
②取10ml 试管4支,3支为测定(3个重复),1支为对照,按下表加入试剂:

试剂 试管号
1 2 3 4(对照)
Tris-HCl缓冲液pH7.0 1.0 1.0 1.0 1.0
酶提取液 0.1 0.1 0.1 0.1(煮死酶液)
蒸馏水 1.7 1.7 1.7 1.7

③将上述4支试管于25℃水浴中预热3min后,逐管加入0.2ml 200 mmol·L-1 H2O2溶液,每加一管立即在紫外分光光度计上测定A240(蒸馏水调零),每隔30s读数一次,共测3min,记录4支试管的测定值。

(3)结果计算:以1 min内A240降低0.1(3支测定管的平均值)为一个酶活性单位(U),先求出3支测定管各自1min内A240降低值,按下式计算CAT活性。

计算公式

    式中,△A240=As0-(As1+As2+As3)/3;As0:煮死酶液对照管吸光度;As1、As2、As3:样品测定管吸光度;Vt:酶提取液总体积(ml);Vs:测定时取酶液的体积(ml);FW:样品鲜重(g)

2.碘滴定法

2.1.原理

    CAT能催化H2O2分解成H2O和O2,其活性大小以一定时间内分解H2O2的量来表示。当反应体系中有过量H2O2存在时,酶与底物(H2O2)反应结束后,用碘量滴定法测定剩余的H2O2。其测定原理是:在钼酸铵催化下,H2O2与KI反应,放出游离I2,然后用Na2S2O3滴定碘。

测定原理公式

    根据空白和测定二者滴定差值,即可计算出酶催化分解H2O2的量

2.2.试剂

(1)1.8 mol•L-1 H2S04:100 mL浓H2S04在搅拌条件下缓慢加入到500mL蒸馏水中,冷却后定容至1000mL。
(2)10%钼酸铵溶液:10g钼酸铵溶于蒸馏水中,定容至100mL。
(3)1%淀粉溶液:称取1g可溶性淀粉,于小烧杯中用20mL水调匀,缓慢加入80mL沸水中,搅拌下加热至沸腾,冷却后贮于滴瓶中。
(4)0.05 mol•L-1硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液:称取Na2S2O3•5H20 25 g,溶于新沸腾并冷却的蒸馏水中,加入约0.1 g Na2C03,溶解后定容至1000mL,贮于棕色试剂瓶中,置于暗处,1d后进行标定。
        标定方法:精确称取K2Cr207(分析纯)0.1500 g于500 mL三角瓶中,加30 mL蒸馏水溶解,加2g KI和5mL 6 mol•L-1 HCl,暗中放置5 min后用蒸馏水定量至200 mL,用上述 0.05 mol•L-1的Na2S2O3溶液滴定,当溶液由棕红色转变至淡黄色时加入1 mL 1%淀粉溶液, 继续滴定至溶液由蓝色变为亮绿色(Cr离子的颜色〉为止,计算出Na2S2O3溶液的确切浓度。
(5)0.01 mol•L-1 Na2S2O3溶液:用上述标定过的Na2S2O3溶液稀释而成,用时现配。
(6)0.2% H2O2溶液:取1 mL30%H2O2用蒸馏水稀释至150 mL,用Na2S2O3溶液标定。
(7)20% KI
(8)CaCO3

2.3.方法步骤

(1)酶液的提取:称取剪碎混匀的植物样品(如叶片等)1.0 g置于研钵中,加0.2 g CaCO3粉 末和2 mL蒸馏水研磨匀浆,移入量瓶中定容至100 mL,摇匀,静置,取上清液10 mL移入100 mL 量瓶中,蒸馏水定容至刻度,摇匀备用。
(2)CAT活性测定:取100 mL三角瓶6个,编号,向各瓶中各加入稀释后的酶液10 mL,同时给4、5、6号瓶中各加5 mL 1.8 mol•L-1 H2SO4,终止酶活性,作为空白对照。将6个三角瓶置于20 ℃恒温水浴中保温5min,向各瓶中准确加入5 mL 0. 2 mol•L-1 H2O2溶液,记录加入的时间,摇匀后20℃水浴中保温,让酶作用5min后,依次向1、2、3号瓶中各加5 ml 1.8 mol•L-1 H2SO4终止酶活性。然后向各瓶中加1mL20% KI,3滴钼酸铵溶液及5滴1%淀粉指示剂,用 0.01 mol•L-1 Na2S2O3标准溶液滴定至蓝色消失,记录滴定数据。

2.4.结果计算

    反应过程中被分解的H2O2的量Q(mg):
Q=[空白滴定值(mL)-样品滴定值(mL)]×Na2S2O3浓度(0.01 mol/L)×1.7

结果计算公式

    式中,Vt:酶液总体积(mL);Vs:测定时取用酶液的量(mL);FW:样品鲜重(g);t:酶作用的时间(min);1.7:消耗1mL 0.01mol·L-1 Na2S2O3标准溶液相当于1.7mg H2O2

2.5.注意事项

(1)凡对240nm波长的光有较强吸收的物质对本实验均有影响,避免之。
(2)当室温超过20℃时,反应温度以室温为准。
(3)紫外分光光度法进行比色测定时,要尽可能测定反应的初速度,因此H2O2溶液加入后应立即进行比色读数。

400-066-8286