1.原理

      C18胶柱(Sep-PaK C18 Cartridge)可根据样品溶质极性不同,分离水溶液中或极性较大的水和有机溶剂的混合物。当甲醇或丙酮等有机溶剂的提取液通过C18柱时,能有效地去除脂溶性色素,C18柱分离法常常用于酶联免疫吸附(ELISA)检测植物激素的样品前处理。

C18胶柱分离装置

2.仪器设备

(1)C18胶柱分离装置;
(2)2 mL离心管:2支。

3.试剂

(1)80%甲醇;(2)纯甲醇;(3)乙醚

4.方法步骤

4.1.样品提取:准确称取植物鲜样1.0000 g.精确至0.100 mg,分三次加入预冷的80%甲醇 3〜4 mL,在冰浴中研磨提取3次(在弱光下进行),合并提取液并定容到5 mL,在4 ℃下 5000 g离心10 min.上清液在一40℃黑暗中可保存一月。暂时不进行分析的样品,可以在称取 鲜重后,加入3 mL80%甲醇,密封保存在一20℃冰箱中。

4.2.分离与纯化:C18胶柱分离纯化装置如上图所示,
其分离过程如下。

(1)新柱的前处理
①用4 mL纯甲醇湿润胶柱,然后排除甲醇
②用4 mL80%甲醇漂洗胶柱,然后排除漂洗液。

(2)加入样品:将步骤1中离心后的上清液(约 2〜3 mL)加入到处理好的胶柱上,控制流速至每分钟30滴左右,弃去开始流出的纯化液约0.5 mL 收集中段流出液1〜1.5 mL备用。

(3)旧胶柱的再生:分离过1个样品后,胶柱就成了旧柱,必须经过再生才能进行下一个样品的分离。
①先用4 mL甲醇漂洗胶柱,排除甲醇:
②用4 mL乙醚通过胶柱,洗去亲脂色素,排除乙醚 (当胶柱上色素残留较多时,可重复此步驟);
③用4 mL80%甲醇漂洗胶柱,然后排除漂洗液;
④可进行下一个样品的分离纯化。
随提取样品液中亲脂色素含量不同,一般每支胶柱可重复使用15〜20次。处理过的样品在 一40℃下保存备用。

5.注意事项

(1).所用材料必须新鲜,随取随用,避免取样时间过长引起内源激素含量改变,
(2).在提取、分离和纯化过程中必须保持低温环境,并避免强光照射。

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