范围
黄曲霉毒素是一种真菌毒素,其存在严重影响农作物的产量及农产品的质量。本方法适用于花生及制品中黄曲霉毒素B1的测定。
基本原理
样品中黄曲霉毒素B1经提取、浓缩，反相C18柱分离后，在激发波长365 nm下,荧光波长440 nm检测。将样品吸收值与标准样品吸收值比较,计算测定结果。
试剂
除非另有说明，仅使用分析纯试剂。
| (1)水:一级。 | (7)无水乙醚。 |
| (2)三氯甲烷 | (8)丙酮。 |
| (3)正己烷或石油醚。 | (9)苯乙腈混合液:量取98 mL苯，加2 mL乙腈,混匀。 |
| (4)甲醇。 | (10)甲醇溶液(55 mL/mL):量取55 ml甲醇,与45 mL水混合。 |
| (5)苯。 | (11) 黄曲霉毒素B1:标准溶液:10 ug/mL. |
| (6)乙腈。 | (12)流动相:色谱纯乙腈。25% HAC(24+76.体积比)。 |
仪器设备
液相色谱系统。
操作步骤
(1)固体样品黄曲霉毒素B1的提取
称取20g粉碎过筛样品,置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30min,静置片刻，以叠成或折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中,待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。如20 mL三氯甲烷，振摇2 min,静置分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10 g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取,三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中,最后用少量三氯甲烷清洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风橱内于65°C水浴上通风挥干,然后放在冰盒上冷却2min~3min后,准确加入1mL苯-乙腈混合液。用带橡皮的滴管管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出,将蒸发皿从冰盒上取下，继续溶解、混合，晶体即消失，再用滴管吸取上清液转移于2 mL具塞进样管中,待HPLC分析。
(2)油类黄曲霉毒素B的提取
称取4 g样品,置于小烧杯中，用20 mL正己烷或石油醚将样品移于125 mL分液漏斗中。用20 mL甲醇水溶液分次清洗烧杯,洗液一 并移人分液漏斗中，振摇2 min,静置分层后,将下层甲醇水浴液移于第二个分液漏斗中,再用5 mL甲醇水溶液重复振摇提取一-次，提取液一并移入第二个分液漏斗中,在第二个分液漏斗中加人20mL三氯甲烷，以下按(1))自“振摇2min静置分层后”起依次操作。
(3)色谱分析
①取黄曲霉毒素B1标样20 ng/mL、40 ng/ mL、80 ng/ mL、160 ng/ mL 、320 ng/mL标准使用液连同样品一起进样，进行HPLC分离，建立工作曲线。
②色谱条件:流速0.8mL/min,进样量10uL,柱温30℃，检测器: EX:365nm.EM:440nm;ATTEN:4;GAIN:X100;FILTER:0.5s。
结果计算
将样品分析所得峰面积代人工作曲线,计算得进样体积所代表的样品所含黄曲霉毒素B1含量A。黄曲霉毒素B1测定结果数值以微克每千克表示(ug/kg)，按下式计算:
式中: X——样品中黄曲霉毒素B1的含量,ug/kg;
A——样品处理液进样分析标准曲线所得黄曲霉毒素B1含量，ug;
V1——加人苯乙腈混合液的体积，mL;
D——样液的总稀释倍数;
V2——进样量,uL;
m——加人苯-乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g。
计算结果表示到小数点后两位。
允许差
两次平行测定结果的绝对值小于两次测定值算术平均值的10%。测定结果用算术平均值表示。
参考资料
[1]SO14718:1998 动物饲料 混合饲料中黄曲霉毒素的测定 高效液相色谱法(Animalfeed-ing stuffs- Determination of aflatoxin B1 content of mLxed feeding stuffs- Method using high-per-formance liquid chromatography)
[2] NY/T 1286- 2007 花生黄曲霉毒素B1的测定 高效液相色谱法
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