土壤微生物碳利用效率（CUE）检测 — ¹⁸O-同位素示踪法

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一、概述

土壤微生物碳利用效率(Carbonl Use Efficiency,CUE)通常指微生物生长与碳吸收的比率，反映了受微生物群落影响的土壤有机碳代谢过程。土壤微生物 CUE 影响土壤碳固持、周转、矿化和温室气体排放等生态系统过程及其对气候变化的生物地球化学反馈，在调节土壤微生物介导的碳和养分转化中起着重要作用，是土壤微生物生物量周转和土壤碳固持的关键调节因素，常作为反映土壤碳同化能力和碳固持潜力的定量指标。

碳利用效率 CUE、CUEa、CUEh关系结构及影响因子

二、检测指标

检测指标	检测方法	同步可出	需样量	联系我们
碳源利用效率（CUE）	18O-同位素示踪法	微生物生物量周转率	50g新鲜土壤
		微生物生长速率
		微生物基础呼吸速率

三、方法原理

氧同位素示踪法基于微生物生长过程中H₂¹⁸O同位素掺入 DNA 的测定估算 CUE。该法假设微生物 DNA 合成中的氧100%来源于水。由于基因组DNA 只在细胞分裂时合成，¹⁸O同位素掺入DNA可以用来计算微生物的生长速率；利用微生物DNA 和微生物生物量碳之间的线性关系，基于¹⁸O-DNA 的增加，估算微生物生物量碳增加动态；结合微生物生长速率和基础呼吸速率，估算微生物CUE。该法还可评估土壤中微生物生物量周转时间，即微生物生物量除以¹⁸O掺入 DNA后的微生物生长速率。近年来，¹⁸O-H₂O标记法已广泛用于估算微生物 CUE。

四、试验材料

1、¹⁸0标记水：¹⁸0丰度为97%或98%，ABX或者Marshall Isotopes

2、超净银囊：规格为φ4.5*6mm，CHNOS

3、顶空瓶：体积20ml，配套的胶垫、铝盖，CNW，可重复使用

4、2ml色谱瓶：颜色为棕色，Thermo，一次性使用

5、土壤DNA提取试剂盒，Powersoil DNA Isolation Kit

6、10ul、100ul、1000ul移液枪，Eppendorf

7、无CO₂空气、气体置换装置、抽气用的气密针(或无菌注射器)及配套针头

8、96孔板、镊子均需自然丰度与标记样品分开

9、高速离心机、烘箱、质检仪

五、操作步骤

1、预培养后的土壤混匀后向棕色色谱瓶内准确称取，称量时尽量避开没有被去除干净的凋落物和根系；将每个预培养土壤匀出600mg均分为两份分别放入2ml棕色色谱瓶中。

2、在一个棕色瓶中加入¹⁸0-H₂0(97.0at%¹⁸0)以调整土壤水的¹⁸0含量为20.0at%¹⁸0，在另一个棕色瓶中加入相同体积的未标记水。标记水缓慢均匀滴入色谱瓶中，盖住色谱瓶盖，在桌面上轻磕瓶底数次，量取土壤高度，以便计算瓶内气体体积，且有助于标记更均匀。

3、随后，将含有样品的小瓶转移到20ml顶空瓶中，盖上盖子，用无CO₂的空气冲洗，使顶空CO₂浓度达到趋于0ppm。准备三个没有土壤的空瓶，并通过所有步骤处理，作为CO₂浓度分析的阴性对照。

4、样品在与样品采集地点平均生长季节温度相等的温度下培养24小时。培养24h后，用注射器从每个瓶中采集10ml气体样品，抽气时注射器需保持竖直，匀速抽取，每个样品可获得12-15ml气体样品；立即使用气相色谱仪系统。

5、气体采集过后应立刻用钳子打开顶空瓶，将棕色色谱瓶取出，并立即转入-20℃冷冻，用来后续提取DNA。使用DNA提取试剂盒(MoBio,Powersoil)提取土壤总DNA。

6、质检：打开质检仪，打开Nano Drop软件，选择核酸，确定测定对象为DNA吸取1.5uL DES清洗质检议2次，吸取1.5uL DES做空白(Blank-F3)吸取1.5uL样品，选择Measure-F1确定，进行测样观察峰值：吸收峰为260，280/260在1.8-2.0之间，260/230在1.8-2.0之间擦拭Nano Drop，测定剩余样记录DNAs浓度及两比值。

7、剩余的DNA提取液在银胶囊中45℃干燥5小时以去除任何水分。随后，用IRMS-TC/EA(ThermoScientific)测定了¹⁸0丰度和总0含量。

六、检测意义

量化土壤微生物 CUE，有助于理解土壤微生物生物量、土壤潜在碳储量、呼吸碳消耗之间的分异，以及土壤长期碳储存对全球变化的响应，提高全球气候变化下土壤碳固持和损失的模拟精度，对于生态系统可持续管理策略亦至关重要。