植物常规理化检测


    谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)是活力较高的转氨酶,其中谷氨酸草酰乙酸转氨酶是催化谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用,谷氨酸丙酮酸转氨酶是催化谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用。

一、测定方法

采用分光光度法测定谷氨酸草酰乙酸转氨酶&谷氨酸丙酮酸转氨酶活力。

二、测定原理

福林-酚试剂在碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原而呈蓝色。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸,因此,可利用蛋白酶分解酪素生成含酚基氨基酸的显色反应,来测定蛋白酶的活力。

三、实验试剂

GOT底物液;GPT底物液;0.05mol/L Tris-HCL缓冲液(pH7.2);0.1mol/L磷酸盐缓冲液;2,4-二硝基苯肼溶液;0.4mol/L氢氧化钠溶液;1mol/L氢氧化钠溶液;丙酮酸标准液;等。

四、实验步骤

①酶粗制剂提取

将植物材料剪碎,取鲜重0.2g左右放入研钵,加缓冲液在冰浴中研磨,得到的匀浆用高速离心机离心20min,取上清液留用。

②谷氨酸草酰乙酸转氨酶GOT 及 谷氨酸丙酮酸转氨酶GPT活力测定

1)谷草转氨酶(GOT)活力测定

取2支10ml试管,管1加酶粗制剂0.1ml和GOT底物液0.5ml,管2加酶粗制剂0.1ml。将二管同时置37℃水浴,60min后取出,均加2,4二硝基苯肼液0.5ml终止反应,管2再加GOT底物液0.5ml。将二管再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L NaOH 5.0ml,混匀,10min后用分光光度计比色,波长500nm,蒸馏水调零点,读取吸光度。将管1吸光度减去管2吸光度,得吸光度差值,查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml)。

绘制工作曲线

取5支试管,按下表配置:

试管号 0.1mol/L磷酸盐缓冲液/ml GOT底物液/ml 丙酮酸标准液/ml
01 0.1 0.5 0
02 0.1 0.45 0.05
03 0.1 0.40 0.10
04 0.1 0.35 0.15
05 0.1 0.30 0.20

配置好后,分别置37℃水浴5min,在将0.5ml的 2, 4-二硝基苯肼溶液分别加入各管中,混匀。再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml,混匀。10min后同上比色,读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度,以各管丙酮酸体积为横座标,以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。

2)谷丙转氨酶(GPT)活度测定

取2支试管,管3作测定管,加酶粗制剂0.1ml和GPT底物液0.5ml,管4作对照管,加酶粗制剂0.1ml。将二管置37℃水浴,30min后取出,各管加2,4-二硝基苯肼液0.5ml终止反应,管4再加GPT底物液0.5ml。将二管再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/LNaOH 5.0ml,混匀,10min后用分光光度计比色,波长500nm,蒸馏水调零点,读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度,得吸光度差值,查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml), 若查得的丙酮酸体积超过0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定。

绘制工作曲线

取6支试管,按下表配置:

试管号 0.1mol/L磷酸盐缓冲液/ml GPT底物液/ml 丙酮酸标准液/ml
01 0.1 0.5 0
02 0.1 0.45 0.05
03 0.1 0.40 0.10
04 0.1 0.35 0.15
05 0.1 0.30 0.20
06 0.1 0.25 0.25

配置好后,置37℃水浴中5min,然后,加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混匀。再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml,混匀。10min后同上比色,读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度,以各管丙酮酸体积为横座标,以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。

五、结果分析

GOT活度,μmol/g•30min=(C×V×20)/(m×2)
GPT活度,μmol/g•30min=(C×V×20)/(m×2)

C――丙酮酸标准溶液的浓度,μmol/ml);
V――由工作曲线查得的丙酮酸体积,ml;
20――稀释倍数;
2――反应时间换算系数;
m――植物鲜重,g。