紫茎泽兰（Ageratina adenophora, AA）是一种快速扩散的入侵植物，能够产生有毒的倍半萜类化合物（如DTD和HHO），抑制本地植物生长，破坏生态系统。尽管其生物质富含氮、磷、钾等营养元素，具有作为有机肥料的潜力，但传统堆肥难以有效降解其毒性成分，且可能残留可繁殖的种子，存在二次扩散风险。近年来，好氧堆肥被证明能部分降低AA的植物毒性，但效率和彻底性仍有不足。黑水虻幼虫（BSFL）已被广泛应用于各类有机废物的处理，能快速降解有机物、减少病原体、回收养分。然而，将堆肥与BSFL处理相结合用于AA生物质解毒和资源化的研究尚未见报道。因此，本研究提出一个两阶段生物转化平台：先堆肥、再BSFL处理，旨在实现AA的高效解毒与肥料化。

1. SPX1/2 在独脚金内酯通路下游调控叶片衰老

研究发现，spx1 spx2双突变体表现出叶片早衰表型，叶绿素含量和光系统II的光化学效率（Fv/Fm）降低（图1a-c），且衰老标记基因NAP 和 SAG12 的表达水平显著升高。过表达spx2可完全恢复双突变体的叶片早衰现象（图1a），且叶绿素含量和光化学效率有所提高，证明 SPX1/2 负调控拟南芥叶片衰老。通过构建 Atd14-1 spx1 spx2、max2-4 spx1 spx2、max4 spx1 spx2 等突变体，发现spx1-cr 和 spx2-cr 单突变体未表现出明显的叶片衰老表型，而 spx1-cr #1 spx2-cr #1 双突变体则表现出叶片早衰表型，说明SPX1/2 在遗传上位于SL信号下游负调控叶片衰老。SL 生物合成基因 MAX4 突变表现出延迟衰老表型，max4 spx1 spx2 三突变体早衰，表明 SPX1/2 对 SLs 调控叶片衰老具有上位性，进一步证明 SPX1/2 在 SL 途径下游发挥作用。

2. AtD14 和 MAX2 介导 SPX1/2 的年龄依赖性降解

通过荧光素酶互补成像（LCI）、双分子荧光互补BiFC、Pull-down和免疫共沉淀Co-IP实验证实 SPX1/2 能够与 AtD14 和 MAX2 发生物理相互作用，且 GR24 处理可促进 AtD14 与 SPX2 的相互作用（图2a-g）。

体内泛素化实验表明，Col-0 中 SPX2 的泛素化明显，而 Atd14 和 max2 突变体中 SPX2 的泛素化减少（图2h）；对 35S:SPX2 - Flag/Col - 0 转基因植物不同生长阶段 SPX2 蛋白水平的分析显示，生殖阶段 SPX2 蛋白水平明显低于幼年阶段（图2i），表明 SPX2 存在年龄依赖性降解；且 Atd14、max2 突变体中生殖生长期 SPX2 蛋白丰度更高（图2j），这进一步表明 SPX2 的年龄依赖性降解可能是通过 AtD14 和 MAX2 介导的 SL 信号通路进行的。

3. SPL9/15 促进叶片中 SL 的生物合成

为探究叶片中SL水平是否与叶片衰老相关，研究员检测了几个SL生物合成基因（MAX1、MAX3和MAX4）在生长期的表达模式。结果发现，合成基因在生殖生长期转录水平显著升高（图3a-c），表明年龄通路可能调控 SL 的生物合成。

进一步研究发现spl9 spl15 双突变体中MAX1、MAX3 和MAX4 表达水平降低，而GFP-rSPL9 转基因植物中这些基因表达水平升高（图3d-f），说明 SL 合成基因的年龄依赖性表达依赖 SPL9/15。同时，Col-0生殖生长期SL（5DS）水平高于幼苗期，spl9 spl15 双突变体中 SL 的年龄依赖性积累消失，max4 突变体则完全无此积累，表明 SL 水平部分依赖于SPL9/15；且年龄依赖性的 SL 生物合成完全依赖于MAX4。通过染色质免疫沉淀-定量 PCR（ChIP-qPCR）、双荧光素酶报告实验和电泳迁移率变动分析（EMSA），证实 SPL9 可直接激活 MAX4 转录。

对spl9 spl15 spx1 spx2 四重突变体进行表型分析发现，spl9 spl15双突变体表现出晚叶衰老表型，而 spl9 spl15 spx1 spx2 四重突变体表现出早衰表型，与spx1 spx2双突变体相似，这表明 SPX1/2 对 SPL9/15 介导的叶片衰老具有上位性，进一步明确了它们在调控叶片衰老过程中的遗传关系。

4. SPX1/2 与 WRKY75 亚家族转录因子相互作用调控叶片衰老

研究人员通过LCI实验筛选叶片衰老相关转录因子，发现SPX1/2 可特异性与WRKY75相互作用（图4a）。BiFC、Pull-down 和 Co-IP 实验进一步证实 SPX2 与 WRKY75 在体内和体外都能相互作用，作用发生在细胞核中（图4b-d）。此外LCI 实验发现 SPX1/2还能与WRKY75的同源蛋白WRKY24 和 WRKY56 相互作用。

为确定 WRKY75 与 SPX2 相互作用的结构区域，构建了 cLUC-WRKY75-N 和 cLUC-WRKY75-C（含 WRKY 结构域）构建体进行 LCI 实验，结果显示当 cLUC- WRKY75-C 与 nLUC-SPX2 共表达时检测到强 LUC 活性（图4e），表明 SPX2 与 WRKY75 的 C 端 WRKY 结构域相互作用。

为探究 SPX1/2 与 WRKY75 的遗传关系，利用已报道的WRKY75-RNAi（W75i）株系，遗传杂交获得spx1 spx2 W75i 株系。RT-qPCR实验显示，与 Col-0 相比，W75i植物中WRKY75及其同源基因WRKY24和WRKY56 的表达水平均降低。与 W75i 株系类似，spx1 spx2 W75i 植株与 Col-0 相比表现出叶片衰老延迟表型（图4f-h）,表明 WRKY75 亚家族转录因子在遗传上位于 SPX1/2 下游参与叶片衰老的调控。

5. SPX1/2 与 WRKY75 亚家族转录因子负调控拟南芥转录组

为探究 SPX1/2-WRKY75 模块调控叶片衰老的分子机制，对 Col-0 和 spx1 spx2 双突变体 WRKY75-RNAi 进行转录组分析，在 spx1 spx2 双突变体中鉴定出 5300 差异表达基因（DEGs），在 W75i 株系中鉴定出2160个DEGs，两者有909个共同的DEGs（图5a）。在这些共同差异表达基因中，约 76% 的DEGs表达趋势相反，并且这些共同DEGs 在热图中呈现出明显的聚类模式（图5b-c）。这些结果表明 SPX1/2 和 WRKY75 在调控共同下游基因方面发挥相反的作用。

对DEGs进行基因本体（GO）富集分析，结果表明这些基因与衰老、植物器官衰老、叶片衰老、胁迫响应以及水杨酸等激素响应相关。实时荧光定量PCR（RT- qPCR）验证发现，spx1 spx2 双突变体中 SID2 的表达水平升高，而 WRKY75-RNAi 植株中SID2的表达水平降低，这与 RNA-Seq 数据一致。这些结果表明SPX1/2 和 WRKY75 亚家族转录因子对南芥转录组的调控作用相反。

6. SPX1/2 抑制 WRKY75 介导的 SID2 转录激活

为研究 SPX1/2 对 WRKY75 调控其靶基因转录活性的影响，研究人员构建了 35S:WRKY75-GFP（W75 OE）转基因株系，实时定量 PCR（RT-qPCR）分析发现，与 Col-0 相比，W75 OE 中 SA 生物合成基因 SID2 的表达水平升高，且在 spx1 spx2 双突变体背景下过表达WRKY75，SID2的表达水平进一步升高，表明SPX1/2 抑制 WRKY75 对 SID2 的转录激活。

ChIP-qPCR 实验显示，spx1 spx2背景下，WRKY75 在 SID2 启动子 W-box 区域（WRKY 家族结合位点）的富集程度显著提高（图5f）。电泳迁移率变动分析（EMSA）实验则证实，SPX1/2 通过抑制 WRKY75 的 DNA 结合能力来抑制其对 SID2 的转录激活。

7. SPX1/2 负调控叶片中 SA 的年龄依赖性积累

为验证 SA 在 SPX1/2 调控衰老中的作用，研究构建了spx1 spx2 sid2-2 三重突变体：三重突变体表现出晚衰老表型，与sid2-2突变体相似（图6a），表明 SPX1/2 和 SID2 通过共同途径调节叶片衰老。

SA含量测定结果表明，Col-0 生殖生长期 SA 含量高于幼苗期，spx1 spx2 中生殖生长期 SA 含量显著升高，而sid2-2 突变体中SA水平随年龄增加的现象完全消失，且 sid2-2 突变可抑制 spx1 spx2 中 SA 的过度积累（图6b），证明 SPX1/2 通过抑制 WRKY75 介导的 SID2 转录，负调控 SA 合成的年龄依赖性增强，最终影响叶片衰老。